Oddelek za molekularno diagnostiko je usmerjen v diagnostične preiskave, hkrati pa pokriva raziskovalno delo v sklopu raziskovalnih projektov.

V okviru Oddelka za molekularno diagnostiko izvajamo diagnostične teste za potrebe genskega svetovanja s področij raka dojke (določanje mutacij v BRCA1 in BRCA2 genih, črevesnega raka [določanje mutacij v MMR genih pri HNPCC (dedni nepolipozni črevesni rak)] in malignega melanoma (določanje mutacij v CDKN2A in CDK4 genih). Za področje limfomov diagnostično določamo klonalnosti limfoidnih proliferacij, ter dokazovanje kromosomskih translokacij pri folikularnem limfomu in pri limfomu plaščnih celic. Poleg rutinskega dela se na Oddelku za molekularno diagnostiko ukvarjamo še z raziskovanjem. En del raziskovanja zajema predpriprave za uvajanje novih diagnostičnih metod, medtem ko je drugi del raziskovanja usmerjen v pripravo tumorskih vakcin in drugih oblik bioloških terapij. Oddelek je odprt tudi za vse konkretne raziskovalne predloge s strani drugih zaposlenih na inštitutu.

PROGRAMSKA USMERITEV ODDELKA ZA MOLEKULARNO DIAGNOSTIKO

Oddelek za molekularno diagnostiko smo zasnovali kot diagnostično-raziskovalni oddelek. To pomeni, da del programa vključuje uvajanje in izvajanje diagnostičnih metod s področja molekularne diagnostike za potrebe Onkološkega inštituta in drugih zainteresiranih zunaj inštituta. Drugi del programa pa predstavlja raziskovalno delo v molekularni in tumorski biologiji. Tudi ta del je usmerjen predvsem v potrebe Onkološkega inštituta, vendar je odprt za sodelovanje tudi z drugimi inštitucijami v Sloveniji in drugod. Sodelovanje poteka prek povezav na raziskovalnih projektih in programih ter tudi v izobraževanju.

DIAGNOSTIKA

Na Oddelku za molekularno biologijo trenutno izvajamo diagnostične teste za potrebe genskega svetovanja s področja raka dojke in molekularno diagnostiko pri limfomih. Prav tako smo razvili in preizkusili tehnike za sekveniranje DNA bolnikov z dednim nepolipoznim črevesnim rakom ter bolnikov z malignim melanomom.

Rak dojke

Avtosomne dominantne mutacije, ki so najpogosteje povezane s karcinomom dojke, so mutacije v supresorskih genih BRCA1 in BRCA2. Verjetnost, da se avtosomna mutacija prenese v naslednjo generacijo, je 50 %, s čimer se pomembno poveča ogroženost za nastanek raka na dojki (pri nosilcih mutacije). Zato je smiselno določati prisotnost teh mutacij in tako pravočasno predvideti ogroženost za nastanek raka na dojki pri preiskovani osebi ter pravilno ukrepati. S temi testi želimo zajeti čim večje število mutacij, ki so značilne za dedni rak dojke. Zato bomo nadaljevali iskanje in določanje najznačilnejših mutacij tako v genu BRCA1 kot v BRCA2. Trenutno določamo naslednje:

BRCA1:

• Mutacija 1806 C>T ex 11
• 300 T>G (C61G) ex 5
• 310 G>A (C64Y) ex 5
• 5382insC (stop 1829) ex 20

BRCA2:

• Slovenska mutacija IVS-16

Limfomi

Eden od izzivov v onkologiji je pravilna opredelitev hematoloških malignomov na podlagi molekularnobioloških znakov. Podobna ali enaka morfologija tumorskih celic ne pomeni vedno tudi molekularne podobnosti. Prav zaradi tega je molekularnobiološka opredeljenost tumorskih celic pomembna za pravilno načrtovanje zdravljenja in spremljanje bolezni.
Klonalnost je diagnostično merilo za ločevanje neoplazije in reaktivnega procesa. Večina neoplastičnih procesov je monoklonalnih (izhajajo iz ene patološko spremenjene celice), reaktivne (benigne) limfoidne proliferacije pa so večinoma poliklonalne.

• Določanje klonalnosti limfoidnih proliferacij z metodo PCR
• Dokazovanje preurejenega gena za težko verigo imunoglobina (IgH) – limfomi tipa B.
• Dokazovanje preurejenega gena za gamaverigo receptorja T (TcRgama) – limfomi tipa T.
• Dokazovanje kromosomske translokacije t(14;18)(q32;q21) pri folikularnem limfomu (bcl-2); klasična PCR ali kvantitativna PCR.
• Dokazovanje kromosomske translokacije t(11;14)(q13;q32) pri limfomu plaščnih celic (bcl-1) z metodo PCR (klasična).

Črevesni rak

Nastanek črevesnega karcinoma je povezan z genetskimi spremembami, ki jih v grobem lahko razdelimo v dve kategoriji: kromosomske nestabilnosti (85% primerov) in mikrosatelitne nestabilnosti (15% primerov). Kromosomske nestabilnosti so najpogostejše na sledečih kromosomih: 5q, 18q, 17p in v delu, kjer se nahaja kRAS onkogen. Geni, ki so najpogosteje prizadeti, so APC (5q), DCC/MADH2/MADH4 (18q), in p53 (17q). Med mutacije, ki so tudi sicer med prvimi mutacijami v zgodnjih fazah nastanka črevesnega raka in so potrjene kot germinalne mutacije, spadajo mutacije v APC genu. Mikrosatelitna nestabilnost je posledica mutacij v popravljalnih genih (MMR – mismatch repair genes), ki niso več sposobni kodiranja normalnih popravljalnih proteinov. Posledica tega so pomnoženi ali manjkajoči deli DNA (največkrat v nekodirajočih regijah), ki spremenijo bralne okvire v različnih genih. Za nastanek raka pa so pomembne mutacije, ki na takšen način nastanejo v onkogenih in tumorskih supresorskih genih, kjer imajo za posledico maligno transformacijo. Tovrstne mutacije so lahko tako germinalne kot somatske.

HNPCC - dedni nepolipozni črevesni rak predstavlja 3-5% vseh črevesnih rakov. Ta oblika črevesnega karcinoma je najpogosteje povezana z mutacijami v MMR genih MLH1, MSH2 in MSH6. Verjetnost, da se razvije črevesni rak je pri nosilcih mutacij v teh genih ocenjena na 80%. Poleg tega so mutacije, ki so značilne za HNPCC pogosto povezane z drugimi vrstami raka kot so rak endometrija, želodca, hepatobiliarnega trakta, jačnikov, rakom na možganih in dr. Najpogostejše so mutacije v MLH1 in MSH2 zato je priporočljivo testiranje teh genov s sekveniranjem v kombinaciji z eno od metod, ki omogočajo detekcijo večjih delecij (primer ťmultiplex ligation-dependent probe amplification – MLPAŤ). Priporočljivo je, da se gensko testiranje opravi po določitvi mikrosatelitske nestabilnosti v tumorju. Mikrosateliti so, namreč, ponavljajoče se sekvence mono- di- ali trinukleotidov ponavadi locirane v intronih. Sprememba v njihovem vzorcu v tumorskih celicah (glede na normalne celice) je pogosta in je indikator za pomanjkljivo delovanje MMR genov.  

Na našem Oddelku smo pripravili in preizkusili primere za pomnoževanje in sekveniranje vzorcev bolnikov za mutacije v MLH1 in MSH2. Preden se odločimo za sekvenčno reakcijo in sekveniranje, vse vzorce bolnikov analiziramo na ťmetlerŤ-ju, kjer ugotavljamo na osnovi razlik v talitvenih temperaturah potrebnih da se razpre dvojna veriga DNA prisotnost neujemanj oz. mutacij. Šele tako izbrane vzorce pomnožimo v sekvenčni reakciji in sekveniramo.

Maligni melanom

Dominantno podedovane mutacije pri bolnikih z malignim melanomom so opisane v dveh genih – CDKN2A in CDK4. Gen CDKN2A kodira protein p16 in alternativno p14. Protein p16 zavira delovanje proteinske kinaze CDK4, s čimer blokira delovanje tumorskega supresorskega gena RB (retinoblastomski gen). Večina mutacij CDKN2A se pri dednemu melanomu pojavlja v eksonih 1α in 2 (redko v eksonu 1β), medtem ko do sedaj ni bilo opisanega primera z mutacijami v eksonu 3. Mutacije v genu CDK4 lahko povzročijo nastanek nefunkcionalnega proteina ali pa preprosto preprečijo vezavo proteina p16 na konsezno sekvenco gena CDK4, zaradi česar postane gen nefunkcionalen.

Na našem oddelku določamo z metodo predhodne analize talitvene krivulje in sekveniranjem vzorcev prisotnost mutacij v CDKN2A genu. Prav zdaj potekajo optimizacijski postopki za pripravo primerjev, ki nam bodo omogočili analizo CDK4 gena. Vzporedno z določanjem mutacij v navedenih genih pri bolnikih, ki so dedno obremenjeni s familiarno anamnezo določamo mutacije (in polimorfizme) v genu za melanokortin MC1R.

TEMELJNE RAZISKAVE S PODROČJA TUMORSKE IMUNOLOGIJE

Pri večini temeljnih raziskav na Oddelku za molekularno diagnostiko poskušamo uporabiti pridobljeno znanje iz molekularne in tumorske biologije. Če je naše rutinsko delo usmerjeno v razvoj in uvajanje novih metod za odkrivanje in spremljanje rakavih bolezni, je večina temeljnih raziskav usmerjenih v pripravo in testiranje novih bioloških zdravil – predvsem tumorskih vakcin.
Tako smo v preteklosti pripravili klasično tumorsko vakcino in ekspresijske kasete za nekaj rekombinantnih vakcin. Naša sedanja usmeritev na tem področju je oblikovanje in testiranje tumorskih vakcin, ki temeljijo na uporabi dendritskih celic. Tekoče raziskave zajemajo različno uporabo dendritskih celic in spremljanje mehanizmov, prek katerih ti pripravki sprožijo protitumorski imunski odgovor.

Sedanji raziskovalni projekti

• Priprava tumorskih vakcin: hibridomi in gensko spremenjene vakcine. Od leta 2004 do 2007. Odgovorni nosilec dr. Srdjan Novaković.

POVEZAVE Z DRUGIMI RAZISKOVALNIMI INŠTITUCIJAMI

Oddelek za molekularno diagnostiko je nastal šele letos (2005), tako da se bodo prave povezave z domačimi in tujimi ustanovami šele oblikovale. Navajam samo nekatere od ustanov, s katerimi trenutno sodelujemo: 

• Medicinska fakulteta v Ljubljani
• Medicinski center za molekularno biologijo, Inštitut za biokemijo
• Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo
• Kemijski inštitut Ljubljana

V tujini sodelujemo z Vrije Universiteit Brussel pri iskanju mutacij v genih BRCA v slovenskih družinah z dednim rakom dojke in/ali jajčnikov, v okviru projekta Genetic and environmental risk factors for melanoma: translation into behavioural change pa sodelujemo pri iskanju in ocenjevanju različnih dejavnikov tveganja za nastanek melanoma. V okviru projekta je predvidena ocena prevalence in penetrance pomembnejših mutacij pri bolnikih z melanomom.

Pomembne objave

• Novaković S. Pregled pomembnejših tumorskih označevalcev v klinični onkologiji. Onkološki inštitut, Ljubljana; 2000.
• Novaković S, Čegovnik U, Menart V, Galvani V, Wraber B. Construction of an expression casete with hTNF-α gene for transient expression of the gene in mammalian cells. Anticancer Res 2001; 21: 365-72.
• Novaković S, Fras PA, Jezersek-Novakovic B.Telomerase activity as a biological marker in some gynecological tumors: comparison with tissue and serum CA 125. In Vivo 2001; 15(4):327-32.
• Glumac N, Hočevar M, Snoj M, Novaković S. Detection of tyrosinase mRNA by an optimised nested RT-PCR in the peripheral blood of patients with advanced malignant melanoma. J Exp Clin Cancer Res 2001; 20(4):529-36.
• Novaković S, Jezeršek Novaković B: A brief overview of the tumor vaccines through the last decade. Radiol Oncol 2002; 36(1):53-62.
• Jezeršek-Novaković B, Frković-Grazio S, Novaković S. The immunohistochemical and serological determination of p53 protein in patients with malignant lymphomas. Neoplasma 2002; 49(1):16-20.
• Novaković S, Hocevar M, Zgajnar J, Besic N, Stegel V. Detection of telomerase RNA in the plasma of patients with breast cancer, malignant melanoma or thyroid cancer. Oncol Rep 2004; 11(1),:245-52.
• Čegovnik U, Novaković S. Setting optimal parameters for in vitro electrotransfection of B16F1, SA1, LPB, SCK, L929 and CHO cells using predefined exponentially decaying electric pulses. Bioelectrochem 2004; 62: 73-82.
• Novaković S. Tumor markers in clinical oncology. Radiol Oncol 2004; 38: 73-83.
• Novaković S, Stegel V. Rapid detection of most frequent Slovenian germ-line mutations in BRCA1 gene using real-time PCR and melting curve analysis. Radiol Oncol 2005; 39: 147-52.
• Stegel V, Kopitar AN, Jezeršek Novaković B, Novaković S. Dendritic cells incubated with irradiated tumor cells effectively stimulate T lymphocyte activation and induce enhanced expression of CD69, CD25 as well as production of IFNgamma and IL4. Int Immunopharm 2006; 6: 79-89.
• Glumac N, Snoj M, Hočevar M, Novaković S. Prognostic significance of tyrosinase mRNA detected by nested RT-PCR in patients with malignant melanoma. Neoplasma 2006; 53: 9-14.
• Jezeršek Novaković B, Novaković S, Frković Grazio S. A single-center report on clinical features and treatment response in patients with intestinal T cell non-Hodgkin’s lymphomas. Oncol Rep 2006; 16: 191-195.
• Cerkovnik P, Perhavec A, Žgajnar J, Novaković S. Optimization of an RNA isolation procedure from plasma samples. Int J Mol Med 2007; 20: 293-300.
• Kopitar AN, Stegel V, Tepeš B, Gubina M, Novaković S, Ihan A. Specific T cell responses to Helicobacter pylori predict successful eradication therapy. J Infect 2007; 54: 257-61.
• Jezeršek Novaković B, Kotnik V, Južnjič Šetina T, Vovk M, Novaković S. Testing of mechanisms of action of rituximab and clinical results in high-risk patients with aggressive CD20+ lymphoma. Radiol Oncol 2007; 41: 23-32.
• Novaković S, Stegel V, Kopitar AN, Ihan A, Jezeršek Novaković B. Preventive and therapeutic antitumor effect of tumor vaccine composed of CpG ODN class C and irradiated tumor cells is triggered through the APCs and activation of CTLs. Vaccine 2007; 25: 8241-8256.