- ŠIFRA PROJEKTA: J3-7460 (D)
- NAZIV PROJEKTA: Faktor modifikacije doze obsevanja ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela okuženega s človeškim virusom papiloma: raziskava in vitro in in vivo na tumorskem modelu laboratorijskih miši (temeljni raziskovalni projekt)
- VODJA PROJEKTA: prof. dr. Strojan Primož
- TRAJANJE: 1. 1. 2016 - 31. 12. 2018
- SESTAVA PROJEKTNE SKUPINE
- RAZISKOVALNE ORGANIZACIJE: (1) ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA in (2) Nacionalni inštitut za biologijo
- FTE: 0,72 FTE
- FINANCIRANJE: Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS)
Vsebinski opis projekta
Človeški virus papiloma (HPV) je bil nedavno prepoznan kot eden najpomembnejših etioloških dejavnikov pri ploščatoceličnem karcinomu ustnega žrela (PCKUŽ). Rezultati meta analize petih prospektivnih serij bolnikov s PCKUŽ, zdravljenih s sočasno radiokemoterapijo, in z retrogradno določenim HPV statusom njihovih tumorjev, kažejo statistično pomembno znižanje tveganja za ponovitev bolezni (razmerje obetov [RO] 0,43, 95% interval zaupanja [IZ] 0,17 – 1,11) in za smrt (RO 0,49, 95% IZ 0,35 – 0,69) pri bolnikih s HPV-pozitivnimi PCKUŽ v primerjavi s HPV-negativnimi tumorji. Do sedaj opravljene raziskave kažejo, da so vzrok za ugodnejše rezultate zdravljenja povečana občutljivost s HPV okuženih tumorskih celic na ionizirajoče sevanje (radioterapijo) in nekatere sistemske kemoterapevtike, ki se uporabljajo za zdravljenje bolnikov s HPV pozitivnimi tumorji. K boljšim rezultatom zdravljenja prispeva tudi boljše splošno stanje bolnikov s HPV-pozitivnim PCKUŽ, kar omogoča intenzivnejše zdravljenje in manj novih primarnih rakov, sicer povezanih z nezdravim načinom življenja. Dobri rezultati zdravljenja s sočasno radiokemoterapijo s preparati na osnovi platine bolnikov s HPV-pozitivnim PCKUŽ so vzpodbudili razmišljanje o znižanju intenzivnosti tovrstnega zdravljenja pri teh bolnikih. Pogoj je ohranitev deleža ozdravitev, ki je dosežena s konvencionalnimi dozami obsevanja in sistemskih kemoterapevtikov na osnovi platine, namen pa zmanjšanje neželenih stranskih učinkov zdravljenja. Glavna ovira pri tem je, da ni znano v kolikšni meri je mogoče znižati odmerek, s katerim obsevamo HPV-pozitiven PCKUŽ, in/ali odmerek sočasno apliciranega sistemskega kemoterapevtika (cisplatina), ne da bi pri tem negativno vplivali na možnost ozdravitve. Zato je namen naše predklinične raziskave in vitro na HPV-pozitivni celični liniji PCKUŽ in in vivo na HPV-pozitivnem tumorskem modelu laboratorijskih miši izvesti študijo modificiranja (deeskalacije) doze obsevanja in/ali cisplatina in določiti (ugotoviti) mehanizme delovanja odgovorne za klinično ugotovljeno povečano občutljivost HPV-pozitivnih PCKUŽ na radioterapijo in sistemsko kemoterapijo. Za dosego namena študije bomo izbrali humane celične linije HPV-pozitivnega in negativnega PCKUŽ. Celična linija bo služila za in vitro in in vivo raziskave odgovora tumorjev na terapijo. V in vitro raziskavah bomo določili stopnjo občutljivosti celic na obsevalno terapijo, terapijo s ciplatinom in kombinacijo obeh. Dobljeni rezultati nam bodo omogočili vpogled v stopnjo povečane radisosenzitivnosti HPV-pozitivnega ploščatoceličnega karcinoma ustnega žrela ter potenciacijo te radisenzitivnosti ob pridruženi terapiji s cisplatinom. Z genotoksikološkimi raziskavami bomo poskusili ovrednotiti razliko v občutljivosti in vrstah DNA poškodb med HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi celicami in vitro. Določevali bomo stopnjo eno in dvoverižnih prelomov DNA po terapiji in tvorbo histonskih kompleksov na DNA. Isti celični liniji bomo uporabili za tumorski model na imunsko oslabljenih laboratorijskih miših. S testom zavore rasti tumorjev in lokalne kontrole rasti tumorjev bomo preverili stopnjo radiosenzitivnosti HPV-pozitivnih in negativnih tumorjev po obsevalni terapiji in podobno kot v in vitro raziskavah ob pridruženi terapiji s cisplatinom. S korelacijo med in vitro in in vivo rezultati bomo določili stopnjo vpletenosti imunskega sistema. Določili bomo faktor modificiranja doze obsevanja med HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi tumorji ter terapevtski indeks glede na poškodbe normalnega tkiva v obsevalnem polju. S imunohistološkimi analizami bomo določili vpliv hipoksije in ožiljenosti tumorjev na razliko v odgovoru na zdravljenje med HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi tumorji, ter preverili vpletentost prirojenega imunskega odziva. Dobljeni rezultati bodo služili kot izhodišče za pripravo nadaljnje klinične raziskave z modifikacijo intenzivnosti standardne radiokemoterapije pri bolnikih s HPV-pozitivnim PCKUŽ.
Faze projekta in njihova realizacija
V raziskavi smo ugotavljali zakaj so s humanim papiloma virusom (HPV) okuženi ploščatocelični karcinomi ustnega žrela bolj občutljivi na obsevanje in kombinirano radiokemoterapijo s cisplatinom od s HPV neokuženih karcinomov. Cilj raziskave je tudi določiti faktor modifikacije doze obsevanja pri HPV-pozitivnih tumorjih pri zdravljenju z radiokemoterapijo.
Raziskava je razvrščena v delovne sklope (DS):
- DS1: Določitev stopnje občutljivosti celic na obsevalno terapijo, terapijo s cisplatinom in na kombinacijo obeh (meseci: 1-12)
Ta delovni sklop je zaključen. S pomočjo testa klonogenosti smo primerjali občutljivost HPV-pozitivnih in HPV-negativnih celic na terapijo s cisplatinom, obsevanje in kombinirano terapijo. Ugotovili smo, da so in vitro HPV-pozitivne celice enako občutljive na terapijo s cisplatinom ter bolj občutljive na radioterapijo in kombinirano terapijo od HPV-negativnih celic. In vitro potenciacija radiosenzitivnosti ob pridruženi terapiji s cisplatinom je prisotna pri obeh celičnih linijah, vendar je pri HPV-pozitivnih celicah bolj izrazita.
- DS2: Ovrednotenje razlike v občutljivosti in vrstah DNA poškodb med HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi celicami in vitro (meseci: 3-15)
Ta delovni sklop je skoraj zaključen. Preverili smo nivo celokupnih poškodb DNA s kometnim testom in nivo dvojnih prelomov DNA s testom fluorescenčnega barvanja fosforiliranih histonov (gH2AX) po terapiji pri HPV-pozitivnih in negativnih celicah. Ugotovili smo, da pri HPV-pozitivnih celicah po terapiji ostane več dvojnih-prelomov DNA, kar kaže na počasnejše popravilo poškodb DNA v teh celicah. Kometni test ni pokazal jasnih rezultatov, verjetno zaradi uporabe cisplatina, ki povzroča zamreženje, s čimer rezultati kometnega testa niso zanesljivi. Tudi izražanje genov, ki sodelujejo pri popravilu DNA ,smo preverili in primerjali pri HPV-pozitivnih in HPV-negativnih celicah. Ugotovili smo, da se izražanje teh genov med linijama že v osnovi razlikuje, hkrati pa je različno tudi po terapiji.
- DS3: Ugotavljanje stopnje radiosenzitivnosti HPV-pozitivnih in negativnih tumorjev po obsevalni terapiji in ob pridruženi terapiji s cisplatinom (meseci: 12-36)
V tem delovnem sklopu smo začeli s preliminarnimi poskusi. Opažamo, da so HPV-pozitivni tumorji bolj odzivni na terapijo od HPV-negativnih. Iz rezultatov nadaljnjih poskusov bomo določili faktor modifikacije obsevalne doze pri HPV-pozitivnih tumorjih glede na HPV-negativne pri zdravljenju z radiokemoterapijo. S tem bomo pripomogli k bolj ciljani obravnavi bolnikov s ploščatoceličnim karcinomom ustnega žrela, okuženim s HPV: ti bolniki bodo lahko za dosego istega terapevtskega učinka obsevani z nižjo dozo. S tako prilagojenim zdravljenjem bo manj neželenih stranskih učinkov, kar bo izboljšalo kakovost življenja teh bolnikov. Dobljeni rezultati potrjujejo, da je biologija HPV-pozitivnih in HPV-negativnih ploščatoceličnih karcinomov ustnega žrela različna. Zato je tudi različna obravnava teh bolnikov smiselna. Nadaljnji rezultati raziskave bodo pomagali določiti za koliko je mogoče znižati dozo obsevanja pri HPV-pozitivnih tumorjih, da ostane stopnja ozdravitev nespremenjena. Raziskovalna hipoteza predpostavlja, da je HPV-pozitivni ploščatocelični karcinom ustnega žrela bolj radiosenzibilen kot HPV-negativen. Zato je pri tej vrsti raka mogoče znižati intenzivnost standardne sočasne radiokemoterapije ne da bi se pri tem znižal delež ozdravitev. Ta hipoteza je v in vitro delu raziskave potrjena, saj smo ugotovili, da so HPV-pozitivne celice bolj občutljive na radio(kemo)terapijo od HPV-negativnih. Sledi še in vivo del raziskave, kjer bomo preverili odzivnost HPV-pozitivnih in negativnih tumorjev na radio(kemo)terapijo na imunskooslabljenih mišjih tumorskih modelih. Od treh zastavljenih ciljev smo dva že dosegli: ugotovili smo, da so HPV-pozitivne celice bolj občutljive na radio(kemo)terapijo ter da je pri njih popravilo poškodb DNA počasnejše, kar je eden od možnih vzrokov za njihovo radiosenzitivnost. Hkrati je tudi izražanje genov, ki sodelujejo pri popravilu DNA pri HPV-pozitivnih in HPV-negativnih celicah različno, kar kaže na razlike v biologiji med njimi. To pomeni, da je različna obravnava bolnikov s HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi tumorji smiselna in (glede na možnost znižanja doze obsevanja ter s tem nižje toksičnosti zdravljenja pri HPV-pozitivnih tumorjih) celo zaželena. V pripravi je znanstveni članek, v katerem bomo opisali do sedaj dobljene rezultate.