Z3-1871

PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU

• ŠIFRA PROJEKTA: Z3-1871
• NASLOV PROJEKTA: Kombinacija elektrokemoterapije in zaviralca poli (adenozin difosfat-riboza) polimeraze pri zdravljenju raka dojke
• CENOVNI RAZRED: B
• VODJA PROJEKTA: dr. Maša Bošnjak
• TRAJANJE: 1.7.2019 - 30.06.2021
• NOSILNA RAZISKOVALNA ORGANIZACIJA: ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA
• FINANCIRANJE: Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS)

Elektrokemoterapija je lokalna tehnika ablacije tumorjev, ki temelji na fizikalni dostavni metodi, elektroporaciji. Za namene elektrokemoterapije, sta najpogosteje uporabljeni citotoksični zdravili cisplatin in bleomicin. Citotoksičnost zdravila temelji na ne‐specifičnih interakcijah z DNA, kar povzroča DNA prelome ali adukte. Z elektrokemoterapijo je mogoče zdraviti različne histološke tipe raka, vendar se odgovor na zdravljenje med različnimi tipi tumorjev močno razlikuje. Najbolj učinkovita je pri bazalnoceličnem karcinomu kjer dosežemo popolni odziv (complete response- CR) pri 90% lezijah, sledi mu melanom s približno 60‐70% CR, pri raku dojke pa dosežemo le 50% CR. Pri zdravljenju raka dojke je elektrokemoterapija indicirana za za zdravljenje metastaz pri bolnikih z napredovalo obliko bolezni, ki so se predhodno zdravili s sistemsko terapijo, kirurgijo ali radioterapijo ali kombinacijo teh modalitet. Ta predhodnja zdravljenja lahko prispevajo k odpornosti metastaz na elektrokemoterapijo, zato je kombinacija elektrokemoterapije z drugimi načini zdravljenja ključna za doseganje večjega števila popolnih odzivov. V naši raziskavi želimo elektrokemoterapijo kombinirati z zaviralcem popravila poškodb DNA, ki deluje na proteina PARP1 in 2. Tako bi kombinacija elektrokemoterapije z zaviralci PARP lahko preprečila popravilo DNA, poškodovano zaradi delovanja citotoksičnih zdravil, kar bi privedlo do okrepljene celične smrti. Cilj projekta je določiti protitumorske učinke kombiniranega zdravljenja; elektrokemoterapija z bleomicinom in cisplatinom v kombinaciji z izbranim zaviralcem PARP za zdravljenje različnih histoloških vrst raka dojke. Učinki bodo ovrednoteni na celičnih kulturah in vitro in na 3D sferoidih in vitro. Na podlagi rezultatov in vitro bo najboljše kombinirano zdravljenje testirano in vivo. Vse ugotovitve so klinično pomembne tudi za nadaljnji razvoj zdravljenja z elektrokemoterapijo.

Faze projekta in njihova realizacija

DS 1 Ocena učinkov elektrokemoterapije same ali v kombinaciji z oplaribom, zaviralcem PARP, v različnih vrstah raka dojke in vitro.

V tem delu bomo raziskali osnovne mehanizme vsakega zdravljenja, elektrokemoterapije in zaviralca PARP olapariba, ločeno in v kombinaciji v različnih celičnih linijah raka dojke. Izbrali smo tri različne celične linije raka dojke, ki najbolje predstavljajo klinični pojav raka dojke. Trojno negativni rak dojke, negativen za hormonske receptorje (estrogenski in progesteronski receptor) in HER2 negativen. Ta vrsta raka je pogostejša pri ženskah z mutacijami BRCA1. Raziskovali bomo tako trojne negativne; BRCA mutiran (HCC 1937), kot tudi ne mutiran rak dojke (MDA-MB-231). Slednji (trojno negativni, BRCA ne mutirani rak dojke) ima med raki dojke najslabšo prognozo, zaradi slabe občutljivosti na zdravljenje. Trojno negativni rak dojke izraža povečano količino PARP 1. Poleg teh dveh tipov raka dojke, bomo raziskali učinke tudi na hormonsko pozitivnem raku dojke, ki je klinično zelo pogosta oblika raka dojke.

Najprej bomo določili citotoksični učinek različnih koncentracij bleomicina in cisplatina v različnih celičnih linijah raka dojke. Določili bomo IC50 za vsako citotoksično zdravilo v vsaki celični liniji. Olaparib, zaviralec PARP, smo izbrali na podatkih iz literature, saj se najbolj obsežno preučujejo in uporabljajo tudi klinično. Preskusili bomo tudi citotoksični učinek olapariba v istih celičnih linijah. Oaparib je lipofilno in dobro prepustno zdravilo, zato za vstop v celico ne potrebuje elektroporacije. Tako bomo testirali olaparib le brez elektroporacije. Kombinirano zdravljenje bo temeljilo na IC50 koncentraciji citotoksičnih zdravil in koncentraciji zaviralca PARP, ki ne povzroča nobenega toksičnega učinka ali pa je le minimalno toksičen. Določili bomo mehanizem celične smrti in poškodbe DNA. Naši predhodni rezultati na celični liniji raka dojke MCF7 (HER2 negativni, estrogensko-pozitivni humani rak dojke) so pokazali, da elektroporacija okrepi citotoksični učinek bleomicina (slika 1, levo). Določili smo IC50 bleomicina v tej celični liniji. Prav tako smo pokazali, da je samo najvišja preizkušena koncentracija olapariba (zaviralca PARP) povzročila pomembno citotoksičnost. Ti rezultati so obetavni in kažejo na izvedljivost predlaganega projekta.

Naloga 1.1. Določitev odmerka bleomicina in cisplatina, ki ubije 50% (IC50) celic raka dojk. Obe zdravili bomo testirali z ali brez elektroporacije.

Cilji: Oceniti preživetje različnih celičnih linij raka dojke po elektroporaciji (EP) z bleomicinom ali cisplatinom v različnih koncentracij. Določili bomo odmerek, ki ubije 50% celic. S tem odmerkom bomo nadaljevali raziskave v kombinaciji z zaviralcem PARP, olaparibom.

Opis: EP bomo preskusili z različnimi odmerki bleomicina (0,01 mM do 1 mM) in cisplatina (0,001 mM do 1 mM). 5000 celic vsake koncentracije, vključno z ne-EP celicami z enakimi koncentracijami bleomicina ali cisplatina, netretiranimi kontrolnimi celicami in samo EP celice, bomo nasadili v vsako vdolbino plošče s 96-vdolbinicami. Po 3h ali 7ih dneh bomo dodali 10 μl Presto BlueTM reagenta, indikatorja preživetja, raztopine, ki temelji na rezazurinu. Le metabolično aktivne celice bodo pretvorile rezazurin v resorufin, s čimer bomo določili relativno število metabolično aktivnih celic v vdolbinici, na podlagi absorpcije ali fluorescence.

Pričakovani rezultati: Določanje občutljivosti različnih celičnih linij raka dojke na citotoksični zdravili, bleomicin in cisplatin. Določitev odmerka IC50 bleomicina in cisplatina, ki bo služila kot koncentracija, uporabljena pri kombiniranem zdravljenju.

Naloga 1.2. Določanje citotoksičnosti oapariba, PARP zaviralca, v izbranih celičnih linijah raka dojke.

Cilji: Da bi ugotovili, ali ima oaparib, zaviralec PARP, ja kakršnekoli citotoksične učinke na izbrane celičnih linije raka dojke.

Opis: Zaviralec PARP, olaparib, je lipofilno in zato lahko prepustno zdravilo. Ker olaparib ne potrebuje pomoči pri prenosu lipidnega dvosloja celice, ga z elektroporacijo ne bo preizkušali. V vsako vdolbinico plošče s 96-vdolbinicami bomo nasadili 5000 celic. Po 3h ali 7ih dneh bomo dodali 10 μl Presto BlueTM reagenta.

Pričakovani rezultati: Določanje citotoksičnega učinka oplariba, zaviralca PARP, v različnih celičnih linijah raka dojke. Pričakujemo, da bo v večini celičnih linij oaparib citotoksičen samo pri velikih odmerkih. Kljub temu pa pričakujemo, da bodo koncentracije, ki povzročajo citotoksični učinek na mutirani celični liniji BRCA, bistveno nižje, kot pri drugih testiranih celicah humanega raka dojke.

Naloga 1.3. Določitev preživetja celic in klonogenosti po kombinaciji elektrokemoterapije z izbranim odmerkom bleomicina ali cisplatina in oaparibom v različnih celičnih linijah raka dojke.

Cilji: Za ugotavljanje sposobnosti preživetja celic po elektrokemoterapiji z IC50 odmerkom bleomicina ali cisplatina v kombinaciji z izbranim odmerkom olapariba, ki ne povzroči ali povzroči samo malo citotoksičnega učinka. Določena bo tudi sposobnost celic, da oblikujejo kolonije po kombinirani terapiji.

Opis: Celice bodo elektroporirane z IC50 odmerkom bleomicina ali cisplatina. 5000 celic vsake koncentracije, vključno z ne-EP celicami z enakimi koncentracijami bleomicina ali cisplatina, netretiranimi kontrolnimi celicami in samo EP celice, bomo nasadili v vsako vdolbino plošče s 96-vdolbinicami. V vsako vdolbinico bomo dodali izbrani odmerek olapariba. Po 3h ali 7ih dneh bomo dodali 10 μl Presto BlueTM reagenta in sposobnost preživetja celic bomo določili, kot je opisano zgoraj. Poleg tega bomo celice vsake skupine nasadile tudi na 6 cm Petrijevko in jih 7-10 dni dali v inkubator, da bodo oblikovali kolonije. Prešteli bomo število kolonij (ena kolonija je sestavljena iz 50 ali več tumorskih celic).

Pričakovani rezultati: Določanje potenciranja citotoksičnega učinka po kombinaciji elektrokemoterapije in oapariba in sposobnosti celic za tvorjenje kolonij.

Nnaloga 1.4. Vrednotenje mehanizmov celične smrti po kombinaciji elektrokemoterapije z bleomicinom ali cisplatinom in zaviralcem PARP olaparibom glede na delež n tip celične smrti (apoptoza ali nekroza).

Cilji: Določiti, kateri mehanizem celične smrti prevladuje po kombinaciji elektrokemoterapije z bleomicinom ali cisplatinom in olaparibom. V primeru več kot enega mehanizma celične smrti bomo ocenili delež vsakega.

Opis: Celice s kombiniranim zdravljenjem in vse ustrezne kontrole bodo inkubirane z FITC kompletom za določanje apoptoze z Aneksin V in nekroze z dodatkom 7-AAD en dan po zdravljenju. Aneksin V je eden izmed znotrajceličnih beljakovin, ki se vežejo na fosfatidilserin (PS) na od kalcija odvisen način. PS se običajno najde le na znotrajcelični strani plazemske membrane v zdravih celicah, vendar se med zgodnjo apoptozo izgubi asimetrija membran in PS se prenese na zunanjo stran. Aneksin V, označen s fluorokromom, lahko nato uporabimo za specifično identifikacijo apoptotičnih celic. Dodali bomo 5 µl Aneksina V, poleg tega pa tudi 5 µL raztopine amino-aktinomicina D (7-AAD), ki bo istočasno določala pomagala pri razlikovanju med nekrotičnimi in apoptotičnimi celicami. Zgodnje apoptotične celice bodo izključile 7-AAD, medtem ko se bodo apoptotične celice pozne faze obarvale pozitivno zaradi prehoda teh barvil v jedro, kjer se vežejo na DNA. Prisotnost Aneksina V in 7-AAD se določi s pretočno citometrijo.

Pričakovani rezultati: Določitev mehanizma (-ov) celične smrti in spremembe deleža celične smrti po kombinaciji terapije v primerjavi s celično smrtjo v posameznih skupinah.

Naloga 1.5. Določanje potenciala poškodbe DNA po kombinaciji elektrokemoterapije in PARP zaviralca, olapariba. Poškodbo DNA bomo določili z obarvanjem proteina y-H2AX in p53 (53BP1).

Cilji: Določiti število prelomov v dvovijačni DNA molekuli in sposobnost celic, da to s časom popravijo.

Opis: Celice bomo nasadili na posebne ploščice z dvanajstimi premičnimi drsnimi komorami, ki so primerne za opazovanje pod konfokalnim mikroskopom. Po različnih časovnih točkah (24h, 48h, 72h) bomo celice fiksirane s paraformaldehidom. Nato bomo celično membrano označili z aglutininom Alexa Fluor® 647, jih permeabilizirali, blokirali in inkubirali preko noči s primarnim anti-y-H2AX in / ali anti-53BP1 protitelesom, čemur sledi inkubacija s sekundarnimi protitelesi. Jedra bodo obarvana s Hoechstom. Slikanje bo izvedeno s konfokalnim mikroskopom LSM 800.

Pričakovani rezultati: Določitev števila dvojnih prelomov verig v opazovanih celicah. Opazovanje celic v različnih časovnih točkah po terapiji nam bo dalo informacije, če lahko celice popravijo te prelome.

DS 2 Ocena učinkov kombinacije elektrokemoterapije in zaviralca PARP na 3D sferoidih in vitro.

V tem delovnem sklopu bomo raziskali učinke kombinirane terapije na 3D celičnih kulturah, sferoidih. Sferoidi bolje posnemajo tumorsko mikrookolje in so uporabno orodje za prevajanje rezultatov iz 2D celičnih kultur in vitro v tumorske modele in vivo. Sestava sferoida je podobna tumorjem, ki imajo osrednji del nekrotičen zunanji del pa je proliferativen.

V naši prejšnji študiji smo že vzpostavili metodologijo za pripravo in gojenje sferoidov celic melanoma B16F10. Prav tako smo preizkusili uveljavljeno metodologijo za pripravo sferoidov celic humanega raka dojke. MCF7 sferoidi so bili uspešno pripravljeni in obarvani s H&E barvanjem. Metoda »Forced floating« omogoča oblikovanje in pripravo za nadaljnje poskuse 3 dni po nasaditvi celic. Na dan 3, ko bo najdaljši premer sferoida dosegel 400 µm, bomo izvedli EP.

Ker je bila metoda potrjena na eni od naših izbranih celičnih linijah humanega raka dojke, pričakujemo, da bo ta specifičen cilj izvedljiv.

Naloga 2.1. Priprava in karakterizacija sferoidov iz različnih celičnih linij humanega raka dojke. Sferoidi bodo pripravljeni z metodo »Forced-floating«. Rast bomo sledili z merjenjem najdaljšega premera, obsega in površine sferoida. Sestavo sferoida bomo določili s histološkim (H&E barvanje) ali imunofluorestenčnim barvanjem.

Cilji: Priprava sferoidov različnih celic humanega raka dojke in opazovanje rasti in sestave sferoidov.

Opis: Sferoidi bodo pripravljeni z metodo »Forced-floating«; celice bomo nasadili v vsako vdolbinico plošče z 96 vdolbinicami in neravnim dnom v ustreznem mediju, dopolnjenem z 10% hidroksipropil metilcelulozo. Plošče bomo centrifugirali 2 minuti pri 1000 rpm in inkubirali 3 dni, dokler sferoidi ne dosežejo približno 400 µm. Rast bomo nato sledili 7 dni, z merjenjem najdaljšega premera, obsega in površine sferoida. Poleg tega bomo sferoide vključili v parafin in obarvali s H&E barvanjem.

Pričakovani rezultati: Določanje razlik v sestavi in hitrosti rasti sferoidov, pripravljenih iz različnih celičnih linij humanega raka dojke.

Nnaloga 2.2. Določanje rasti sferoidov z merjenjem premera sferoidov po elektrokemoterapiji z izbranim odmerkom cisplatina ali bleomicina in zaviralca PARP olapariba.

Cilji: Določanje zakasnitve rasti sferoidov pri zdravljenju s kombinirano terapijo v primerjavi z vsakim posameznim zdravljenjem.

Opis: Vsak sferoid bo elektroporiran s cisplatinom ali bleomicinom. V vsakem dobro izbranem zaviralcu PARP bo dodan olaparib v odmerku, ki ne povzroča ali ima malo citotoksičnega učinka pri človeških rakih dojke. Rast nato sledimo 7 dni z merjenjem najdaljšega premera.

Pričakovani rezultati: Določitev učinkovitosti kombinirane terapije na sferoidih. Primerjava učinkovitosti kombinirane terapije v 2D celičnih kulturah z učinkovitostjo kombinirane terapije v 3D celičnih kulturah.

Naloga 2.3. Vrednotenje parametrov celične smrti po kombinirani terapiji. Opravili bomo histopatološko obarvanje sferoidov, da bi ocenili učinke kombinirane terapije. Ocenili bomo tumorsko nekrozo (obarvanje H&E) in apoptozo (kaspazo-3) ter preostali proliferativni del sferoida (Ki67).

Cilji: Določiti mehanizme celične smrti (apoptozo ali nekrozo) in sposobnost celic v sferoidu za ponovno rast iz preostalega proliferativega dela.

Opis: 3 dni po zdravljenju bomo sferoide fiksirali v cinkovem fiksativu, jih vklopili v parafin in narezali na 2-μm debele rezine. Prve rezine bomo obarvali s H&E za nekrozo. Druge rezine bomo obarvali s primarnim protitelesom proti kaspazi-3 za apoptozo, tretje pa s primarnim protitelesi proti Ki-67 za preostali proliferativni del. Naslednji dan bomo kot kolorogeni reagent uporabil s peroksidazo konjugiran streptavidin-biotinski sistem, čemur bo sledila kontrastna barva s hematoksilinom za obdelavo drugega in tretjega dela. Slike imunohistokemično obarvanih rezin bodo zajete z DP72 CCD kamero (Olympus), priključeno na mikroskop BX-51 (Olympus). Določili bomo odstotek tumorske nekroze in število pozitivnih celic Ki-67 ali kaspaze-3.

Pričakovani rezultati: Določitev učinkov mehanizmov celične smrti po kombinirani terapiji; koliko je nekroze in/ali apoptoze, ter preostalega proliferativnega dela.

DS 3 Ocena učinkov kombinacije elektrokemoterapije in zaviralca PARP na humanem raku dojke in vivo.

V tem delovnem sklopu bomo raziskali, kako deluje kombinacija terapije na modelih humanega raka dojk in vivo. Po kombinirani terapiji bomo opazovali zaostanek rasti tumorjev. Ugotovitve lahko služijo za nadaljnjo translacijo znanja v klinično okolje, za zdravljenje kožnih metastaz raka dojke z elektrokemoterapijo. Kombinacija lahko potencialno prispeva k večjemu številu popolnih tumorskih regresij zaradi potenciranja poškodbe DNA, ki jo povzroči elektrokemoterapija s cisplatinom ali bleomicinom. Histopatološko vrednotenje zdravljenih tumorjev bomo ovrednotili z odvzemom tumorskega tkiva.

Naloga 3.1. Določanje zaostanka rasti tumorjev po elektrokemoterapiji sami ali v kombinaciji z zaviralcem PARP olaparibom, pri tumorjih humanega raka dojke v mišjem modelu in vivo.

Cilji: Ugotoviti učinke same elektrokemoterapije ali elcetrokemoterapije v kombinaciji z zaviralcem PARP, olaparibom, na tumorjih humanega raka dojk, ki bodo rasli na miših.

Opis: Človeške humanega raka dojke bomo injicirali v bok miši SCID, da se tvorijo tumorji. Posamezne terapije ali kombinirana terapije bomo izvajali na približno 40 mm3 velikih tumorjih. Citotoksična zdravila bodo aplicirana v skladu s standardnimi operativnimi postopki za elektrokemoterapijo, bleomicin intartumorsko ali intravenozno in cisplatin intratumorsko. Zaviralec PARP bomo injicirali, kot je opisano v objavljenih študijah; intraperitonealno, več dni zapored. Velikost tumorjev bomo določili z merjenjem treh pravokotnih premerov tumorjev vsaka 2 dneva z digitalnim kljunastim merilnikom Vernier. Nezdravljeni tumorji bodo služili za izračun zakasnitve rasti, med nezdravljenimi tumorji in tumorji, zdravljenimi bodisi z elektrokemoterapijo ali s kombinacijo elektrokemoterapije in zaviralca PARP.

Pričakovani rezultati: Določanje zakasnitve rasti tumorja pri zdravljenih skupinah in s tem določitev učinkovitosti zdravljenja.

Naloga 3.2. Vrednotenje deleža celične smrti in preostalih viabilnih delov s histopatološkim obarvanjem tumorskih rezin za tumorsko nekrozo (obarvanje H&E) in apoptozo (kaspazo-3) kot tudi preostali proliferativni del tumorja (Ki67).

Cilji: Določiti učinkovitost terapije v mehanizmih celične smrti (apoptoza ali nekroza) in sposobnost tumorjev, da ponovno vzniknejo iz živih preostalih delov.

Opis: Tri dni po terapiji bomo tumorje odvzeli in fiksirali v cinkovem fiksativu čez noč. Nato jih bomo vstavili v parafin in narezali na 2 μm debele rezine. Prvi del vsakega vzorca tumorja bo obarvan s H&E obarvanjem (nekroza). Preostali deli bodo obarvani bodisi s primarnim protitelesom proti Ki-67 (proliferacija) bodisi proti kaspazi-3 (apoptoza) čez noč, naslednji dan pa bomo kot kolorogeni reagent uporabil peroksidazo konjugirano s streptavidin-biotinskim sistemom, ki mu bo sledil hematoxylin. Slike imunohistokemično obarvanih rezin bomo zajeli z DP72 CCD kamero (Olympus), priključeno na mikroskop BX-51 (Olympus). Določili bomo odstotek tumorske nekroze in število pozitivnih celic Ki-67 ali apoptotičnih celic (kaspaza-3).

Pričakovani rezultati: Pričakujemo, da bo kombinirana terapija, elektrokemoterapija in zaviralec PARP povzročila močno povečano nekrozo ali apoptozo, z nič ali le malo vidnega preostalega viabilnega dela