• ŠIFRA PROJEKTA: J3-6796 (D)
• NAZIV PROJEKTA: Translacijska onkologija: razvoj in validacija imunsko genske terapije z interleukinom-12 v kombinaciji s kirurgijo pri oralnih in kožnih tumorjih psov
• VODJA PROJEKTA: prof. dr. Maja Čemažar
• TRAJANJE: 1.7.2014 - 30.06.2017      
• SESTAVA PROJEKTNE SKUPINE     
• RAZISKOVALNE ORGANIZACIJE: (1) ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA, (2) Univerza na Primorskem Fakulteta za vede o zdravju, (3) Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta
• FTE:
• FINANCIRANJE: Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS)

Vsebinski opis projekta

• Izhodišče in predstavitev problema: Genska terapija raka, s katero spodbujamo imunski sistem, pridobiva na veljavi. Trenutno je na področju humane onkologije v teku 59 študij imunske genske terapije, od tega 11, kjer se uporablja plazmidna DNA, ki nosi zapis za citokin interlevkin 12 (IL-12), kar kaže na visok potencial uporabnosti te terapije. Kljub velikemu napredku na področju raziskav genske terapije, pa še vedno ostaja vprašanje varnosti in tudi učinkovitosti tovrstnih terapij v kombinaciji z standardnim zdravljenjem. Pri uvajanju terapij v humano medicino, se vedno bolj zavedamo pomembnosti kliničnih študij v veterinarski medicini, predvsem na psih, saj spontani tumorji psov in podobnost imunskega sistema med psmi in ljudmi, predstavlja dober translacijski most za hitrejši prenos v klinične študije v humani onkologiji. Namen predlaganega projekta je razviti in validirati varno adjuvantno gensko terapijo z IL-12 v kombinaciji s kirurgijo pri oralnih in kožnih tumorjih psov. V ta namen bomo naredili plazmidno DNA, ki bo nosila zapis za pasji IL-12 pod kontrolo promotorja specifičnega za kožo. Plazmid bomo validirali na nivoju celičnih kultur in tumorskih modelov in vivo. Pripravili bomo protokol klinične študije, jo prijavili na ustrezne inštitucije in začeli z vključevanjem pacientov.
• Metode dela: Plazmide, ki bodo kodirali za pasji IL-12 pod kontrolo tkivno specifičnih promoterjev in z genom za rezistenco na kanamicin bomo pripravili s standardnimi molekularno biološkimi metodami, plazmide, ki bodo brez gena za odpornost na antibiotik, pa po navodilih dobavitelja ORT® tehnologije. Primerne bakterijske seve bomo transformirali s pripravljenimi plazmidi in proizvedli večje količine plazmidnih DNA brez endotoksina, ki jih bomo uporabili v nadaljnjih poskusih. Izražanje vnešenih plazmidov bomo določevali s testom RT-PCR in ELISA na različnih pasjih tumorskih in normalnih celicah. Poleg tega pa bomo spremljali učinek pripravljenih plazmidov na delovanje različnih celičnih kultur s testom proliferacije. Na pasjih tumorskih ksenograftih iduciranih v golih miših bomo določili protitumorsko delovanje pripravljenih plazmidov, ter opavili histološko analizo tumorjev. Protitumorsko delovanje bomo določali s testom zaostanka v rasti ter testom lokalne kontrole rasti tumorjev. Klinična študija se bo izvajala na Kliniki za male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani.
• Izvajanje projekta: Projekt se bo izvajal v laboratorijih pri vseh 5 sodelujočih partnerjih, kjer je za izvajanje eksperimentalnega dela zagotovljena vsa raziskovalna oprema za molekularno biološke tehnike, za celične kulture, za imunocitokemične preiskave in testiranje protitumorskega učinka na tumorskih modelih ter za izvajanje klinične študije. Raziskovalci na projektu imajo bogate izkušnje na področju priprave plazmidov, izolacije celičnih kultur, uporabe elektroporacije za vnos različnih molekul v celice in tkiva, priprave kliničnih protokolov in izvajanje elektroporacije na veterinarskih pacientih.
• Vodenje in koordinacija projekta se bo izvajala z neposrednimi kontakti z udeleženci na projektu in rednimi delovnimi sestanki.

Relevanca in potencialni vpliv rezultatov: Predlagan projekt je zasnovan kot predklinični in klinični projekt, ki obravnava pomembne teme na področju varne uporabe genske terapije v kliničnih okoljih. Rezultati projekta, če bo uspešen, imajo lahko vpliv na izvajanje adjuvantne imunsko genske terapije v veterinarski onkologiji in predvsem na translacijo tovrstnih kliničnih študij genske terapije v humano onkologijo, ne samo v Sloveniji, ampak tudi širše.

Faze projekta in njihova realizacija

Glavni cilj predlaganega projekta je razvoj in validacija imuno-genske terapije z interlevkinom 12 v kombinaciji s kirurgijo za zdravljenje oralnih in kožnih tumorjev psov. Za dosego cilja smo projekt razdelili v več delovnih sklopov (DS), ki vsebujejo posamezne naloge.

DS 1: PRIPRAVA VARNEJŠIH EVKARIONTSKIH EKSPRESIJSKIH PLAZMIDOV Z ZAPISOM ZA PASJI IL-12

V tem DS bomo najprej izbrali in pridobili izvorne plazmide za pasji IL-12 in tkivno specifični promotor. Plazmid, ki kodira pasji IL-12 kot enoverižni fuzijski protein bomo pridobili od prof. dr. Geralda Gileno de Sa´ Oliveira iz Fundacije Oswaldo Cruz (Fundação Oswaldo Cruz), Brazilija (dos Santos, LR, et al. (2004). Recombinant single-chain canine interleukin 12 induces interferon gamma mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells of dogs with visceral leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol 98: 43-48). Najprej bomo pripravili plazmid s pasjim IL-12 pod transkripcijsko kontrolo CMV promotorja, ki bo služil kot kontrolni plazmid z visokim in konstitutivnim izražanjem terapevtskega gena. Gen za pasji IL-12 bomo nato klonirali v vektor s tkivno specifičnim promotorjem. Na podlagi izbora terapevtskega gene za pasji IL-12 in planiranega protokola za transfekcijo, smo izbrali promotor za kožo, natančneje fibroblaste v vezivnem tkivu, kot tkivno specifični promotor, ki omogoča tako sistemsko sproščanje transgenov kot tudi lokalno ciljanje. V trenutno potekajočem projektu smo v sodelovanju z našim partnerjem prof. dr. David A. Dean iz Univerze v Rochester-ju (University of Rochester), ZDA, kot najprimernejši tkivno specifični promotor za kožo izbrali promotor gena za kolagenazo 1a2. Izbrani promotor smo tudi že testirali in ovrednotili z uporabo reporterskega gena za zeleni fluorescentni protein. V nadaljevanju tega DS bomo sekvence s terapevtki genom za pasji IL-12 vezanim na konstitutiven ali tkivno specifičen promotor klonirali v varnejši vektor, ki je bil narejen z namenom, da je v skladu z dokumentom ameriške administracije za hrano in zdravila (Food and Drug Administration, FDA): Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm074770.htm) in dokumentom evropske agencije za zdravila (European Medicines Agency EMA): Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development (www.ema.europa.eu/ema/pages/includes/document/open_document.jsp?webContentId=WC500122743). Ta vektor ima evkariontske DNA sekvence omejene na tiste, ki so nujno potrebne za izražanje, tako da se zmanjša verjetnost kromosomske integracije na minimum, in gen za kanamicinsko rezistenco za selekcijo v E. coli, kajti ampicilin lahko povzroči preobčutljivostno reakcijo pri posameznih bolnikih. Omenjene sekvence s terapevtskim genom za pasji IL-12 bomo dodatno poskušali klonirati v vektor brez gene za antibiotično rezistenco z uporabo ORT® tehnologije (http://www.cobrabio.com/Services/Technologies/Antibiotic-free-Maintenance-System) in tako pridobiti plazmide, ki so še bolj primerni za klinično testiranje, saj so še varnejši, ker sploh ne vsebujejo zapisa za rezistenco na antibiotik. Če bomo uspešni pri zadnjem koraku tega DS, bomo tako pridobljene plazmide brez antibiotične rezistence uporabili v nadaljnjih poskusih (DS 2): in vitro, za ovrednotenje izražanja, in in vivo, za ovrednotenje njihove terapevtske učinkovitosti. Če ne bomo uspešni pri pripravi plazmidov brez antibiotične rezistence, pa bomo v nadaljnjih poskusih uporabili samo standardne vektorje (z rezistenco na kanamicin).

Naloga 1.1: Pridobitev izvornega plazmida za pasji IL-12 in izbor tkivno specifičnega promotorja (Meseci: 0 – 3) (Partnerji: Onkološki inštitut Ljubljana – OI)

Cilji: Izbrati in pridobiti izvorne plazmide s pasjim IL-12 in tkivno specifičnim promotorjem za kožo za pripravo rekombinantne plazmidne DNK

Opis: Izvorni plazmid za pasji IL-12 bomo pridobili od prof. dr. Geralda Gileno de Sa´ Oliveira iz Fundacije Oswaldo Cruz (Fundação Oswaldo Cruz), Brazilija. Izvorni plazmid z tkivno specifičnim promotorjem smo že pridobili od prof. dr. Davida A Deana iz Univerze v Rochestru, ZDA. Na podlagi nukleotidne sekvence obeh plazmidov bomo pripravili načrt kloniranja za pripravo rekombinantnih plazmidnih DNK.

Pričakovani rezultati: Izbor in pridobitev plazmidov s tkivno specifičnim promotorjem in pasjim genom za IL-12 in priprava načrta kloniranja.

Naloga 1.2. Priprava plazmidov z genom za pasji IL-12 in konstitutivnim CMV promotorjem ter tkivno specifičnim promotorjem z uporabo varnejših vektorjev (Meseci: 3 – 12) (Partnerji: OI, Univerza na Primorskem, Fakulteta za vede o zdravju (UP FVZ))

Cilj: Pripraviti varnejše plazmide z genom za pasji IL-12 pod transkripcijsko kontrolo konstitutivnega in tkivno specifičnega promotorja z rezistenco na kanamicin ali brez rezistence na antibiotik.

Opis: Plazmide z genom za IL-12 pod transkripcijsko kontrolo konstitutivnega in tkivno specifičnega promotorja bomo pripravili z uporabo standardnih molekularno bioloških metod restrikcije in ligacije in transformirali v ustrezne bakterijske seve. Sekvenco s terapevtskim genom vezanim ali na konstitutivni ali na tkivno specifični promotor bomo klonirali v vektor z genom za kanamicinsko rezistenco za selekcijo v E. coli, ki pa se ne izraža v evkariontskih celicah. Za pridobitev plazmidov brez rezistence na antibiotike bomo takšne plazmide nadalje obdelali z uporabo ORT® in X-mark™ tehnologije, ki smo jo dobili za uporabo v akademske namene od dobavitelja Cobra Biomanufacturing PLC (Oxford, UK). Podatki o sekvenci plazmidov, bakterijskih sevih in protokolih so glede na podpisan Sporazum o prenosu materiala (Material Transfer Agreement) zaupni. ORT® tehnologija temelji na s plazmidom posredovani represorski titraciji, ki aktivira gostiteljski selekcijski marker z uporabo ORT bakterijskih sevov, ki so načrtovani tako, da vsebujejo esencialen gen dapD pod transkripcijsko kontrolo lac operatorja/promotorja (lacO/P). V odsotnosti induktorja, na primer IPTG, takšen sev ne more rasti zaradi represije gena za dapD z vezavo LacI represorskega proteina na LacO/P. Transormacija s plazmidom, ki vsebuje lac operator (lacO) učinkovito spodbudi izražanje dapD s titracijo lacI iz operatorja. Regulacija esencialnih genov omogoči rast bakterij in vzdrževanje rekombinantnih plazmidov, ki vsebujejo LacO. ORT® se uporablja v kombinaciji z X-mark™, ki omogoča pripravo plazmidov z uporabo učinkovite selekcije v posebnem E. coli sevu in poznejšo transformacijo v ORT® sev, kjer z Xer rekombinacijo izreže gen za antibiotično rezistenco ter tako nastane za 1 kb manjši plazmid, ki ga lahko stabilno vzdržujemo z ORT®. S tem močno pospešimo pripravo plazmidov v ORT sevih. Uspešnost priprave plazmidov bomo potrdili z restrikcijsko analizo in sekveniranjem.

Pričakovani rezultati: Priprava funkcionalnih in stabilnih plazmidov z antibiotično rezistenco na kanamicin ali brez antibiotične rezistence, ki jih bomo v nadaljnjih poskusih (DS 2) uporabili za ovrednotenje terapevtske učinkovitosti.

DOGNANJA:

D 1.1: Izbor in pridobitev izvornih plazmidov za pasji IL-12 in tkivno specifični promotor za kožo.

D 1.2: Priprava varnejših plazmidov z genom za pasji IL-12 pod transkripcijsko kontrolo tkivno specifičnega in konstitutivnega promotorja z antibiotično rezistenco na kanamicin ali brez antibiotične rezistence.

MEJNIKI:

Mejnik 1 : Funkcionalen in stabilen plazmid z genom za pasji IL-12 pod transkripcijsko kontrolo tkivno specifičnega in konstitutivnega promotorja z antibiotično rezistenco na kanamicin.

Mejnik 2: Funkcionalen in stabilen plazmid z genom za pasji IL-12 pod transkripcijsko kontrolo tkivno specifičnega in konstitutivnega promotorja brez antibiotične rezistence.

DS 2: IN VITRO IN IN VIVO VALIDACIJA PLAZMIDOV

V tem DS bomo ovrednotil plazmide pripravljene v prvem DS. Najprej bomo plazmide testirali v in vitro poskusih na različnih pasjih in humanih celičnih linijah. Ekspresijske profile plazmidov bomo določili s kvantifikacijo izražanja IL-12 na ravni mRNA in na ravni proteinov. Ekspresijske profile plazmidov s pasjim IL-12 bomo primerjali z ekspresijskim profilom plazmida s humanim IL-12, ki smo ga zaradi visoke homologije s pasjim IL-12 uporabljali že v naši predhodni klinični raziskavi na področju veterinarske onkologije. Dodatno bomo ekspresijske profile obeh plazmidov s pasjim IL-12 (tako s tkivno specifičnim kot tudi s konstitutivnim promotorjem) primerjali v različnih pasjih tumorskih in normalnih celičnih linijah in tako določili tkivno specifičnost plazmida s pasjim IL-12 pod transkripcijsko kontrolo tkivno specifičnega promotorja. Ustrezne pasje celične linije niso dobavljive pri komercialnih dobaviteljih, zato smo po pregledu literature kontaktirali raziskovalce, ki uporabljajo ustrezne pasje celične linije. Prof. dr. Takayuki Nakagawa iz Univerze v Tokiju, Japonska, je privolil v sodelovanje in nam ponudil njihove pasje melanomske celične linije ter, kot DVM tudi svetovanje glede klinične študije (Inoue, K, et al. (2004). Establishment and characterization of four canine melanoma cell lines. The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 66: 1437-1440). Kot zadnji korak v tem DS bomo preverjali terapevtsko učinkovitost plazmidov in vivo na golih miših, s ciljem dokazati protitumorsko učinkovitost plazmidov na ksenograftih pasjega melanoma na golih miših in tako pripeljati pripravljene plazmide bližje klinični študiji, ki je planirana za DS 3. Kot metodo vnosa plazmidov v celice bomo uporabili elektoroporacijo, ker ima tako naš (OI), kot partnerski (UL VF) oddelek dolgoletne (~20 let) izkušnje s to metodo v in vivo poskusih na laboratorijskih živalih in tudi v kliniki.

Naloga 2. 1: Izbor in pridobitev različnih pasjih tumorskih in normalnih celičnih linij (Meseci: (6 – 9) (Partnerji: OI, Univerza v Tokiju (UT))

Cilj: Izbrati in pridobiti različne pasje tumorske in normalne celične linije.

Opis: Različne celične linije pasjega melanoma bomo pridobili od prof. dr. Takayuki Nakagawa iz Univerze v Tokiju. Za nadaljnje in vitro in in vivo poskuse bomo izbrali 4 pasje celične linije. Celično kulturo normalnih pasjih fibroblastov bomo kupili pri priznani banki celičnih kultur ATCC, USA. Celice bomo gojili v ustreznih medijih, namnožili in shranili v naši celični banki v tekočem dušiku za nadaljnje poskuse.

Pričakovani rezultati: Uspešno gojenje različnih pasjih celičnih linij.

Naloga 2.2.: Določanje ekspresijskih profilov plazmidov s pasjim IL-12 na različnih celičnih linijah (Meseci: 9 – 18) (Partnerji: OI, UP FVZ)

Cilj: Primerjati ekspresijske profile plazmidov s pasjim IL-12 z ekspresijskim profilom plazmida s humanim IL-12 in določiti tkivno specifičnost plazmida s tkivno specifičnim promotorjem in pasjim IL-12.

Opis: Pripravljen plazmide bomo transfecirali z elektroporacijo v različne humane celične linije. Ekspresijske profile plazmidov bomo ovrednotili z določanjem izražanja IL-12 na nivoju mRNA s qPCR in na proteinskem nivoju s testom ELISA. Ekspresijske profile plazmidov s pasjim IL-12 bomo primerjali z ekspresijskim profilom plazmida s humanim IL-12 v različnih humanih in pasjih celičnih linijah. Med sabo bomo tudi primerjali ekspresijske profile obeh plazmidov s pasjim IL-12 in tako določili tkivno specifičnost plazmida s pasjim IL-12 pod transkripcijsko kontrolo tkivno specifičnega promotorja. Če bomo uspešno pripravili tudi plazmide brez antibiotične rezistence (DS 1, Naloga 1. 2), bomo med seboj primerjali tudi ekspresijske profile plazmidov z antibiotično rezistenco s plazmidi brez gena za antibiotično rezistenco.

Pričakovani rezultati: Ovrednotenje plazmidov s pasjim IL-12.

Naloga 2.3.: Ovrednotenje terapevtske učinkovitosti plazmidov in vivo na golih miših (Meseci: 18 – 24) (Partnerji: OI, UP FVZ)

Cilj: Določiti terapevtsko učinkovitosti plazmidov z genom za pasji IL-12 in vivo.

Opis: Terapevtsko učinkovistost plazmidov bomo določali na ksenograftih pasjega melanoma na golih miših. Gole miši smo izbrali na podlagi njihovega imunološkega statusa. Miši imajo namreč oslabljen/okvarjen imunski sistem, kar omogoča rast pasjih ksenograftov, po drugi strani pa imajo še vedno celice in molekule prirojene odpornosti, ki so tarče IL-12, tako da lahko pričakujemo, da bomo lahko učinkovito sledili protitumorsko delovanje pasjega in humanega IL-12. Testirali bomo samo plazmide, ki jih bomo izbrali na podlagi rezultatov in vitro ekspresijskih testov (Naloga 2.2.). Transfekcijo plazmidov bomo izvedli s peritumoralnim vbrizganjem plazmidne DNA, ki ji bo sledila elektroporacija z ustreznimi parametri elektičnih pulzov. Protitumorsko učinkovitost bomo ocenili s testom zaostanka v rasti tumorjev in testom lokalne kontrole rasti tumorjev. Poleg tega bomo naredili tudi histološko analizo za ovrednotenje nekroze, apoptoze in infiltracije imunskih celic ter imunohistološko barvanje imunskih molekul, kot so IL-12, IFNγ in drugi.

Pričakovani rezultati: Ovrednotenje terapevtske učinkovitosti plazmidov z genom za pasji IL-12.

DOGNANJA:

D 2.1: Izbor in pridobitev različnih pasjih tumorskih in normalnih celičnih linij.

D 2.2: Poročilo ovrednotenja plazmidov s pasjim IL-12.

D 2.3: Poročilo ovrednotenja terapevtske učinkovitosti plazmidov z genom za pasji IL-12.

MEJNIK:

Mejnik 3. Rezultati ovrednotenja terapevtske učinkovitosti plazmidov z genom za pasji IL-12.

DS 3. PRIPRAVA KLINIČNE ŠTUDIJE

V tem delovnem sklopu se bomo posvetili pripravi na začetek klinične študije. Med naloge spada priprava protokola klinične študije in prijava klinične študije na pristojne organe. Zaradi uporabe gensko spremenjenih organizmov (bakterij) pri pripravi plazmidne DNA v klinični študiji, je potrebna tudi priprava in prijava ocene tveganja za prijavo klinične študije na Ministrstvo za kmetijstvo in okolje RS. Priprava dokumentov za lastnike živali (opis študije in obveščen pristanek). 

Naloga 3.1. Priprava protokola klinične študije (Meseci: 12-15) (Partnerji: OI, Univerza v Ljubljani-Veterinarska fakulteta (UL VF))

Cilj: Pripraviti protokol za klinično študijo, ki bo slonel na kliničnih študijah, kjer smo uspešno uporabili elektrogensko terapijo (EGT) in elektrokemoterapijo (ECT).

Opis: Protokol, ki ga bomo uporabili v klinični študiji, bo nadgradnja protokolov iz dosedanjih študij. V teh študijah smo uporabljali elektrokemoterapijo v povezavi z cisplatinom pri zdravljenju mastocitomov pri psih. Elektroporacija se v medicine namreč ne uporablja samo za vnos genskega materiala v celice, ampak tudi za vnos kemoterapevtikov, bleomicina in cisplatina – elektrokemoterapija. Elektrokemoterapija je že uveljavljena terapija za zdravljenje humanih in živalskih (pasjih, mačjih in konjskih) tumorjev v več Evropskih državah. Trenutno se uporablja predvsem za zdravljenje kožnih tumorjev različnih histoloških tipov. Elektrogensko terapijo z IL-12 smo testirali kot samostojno terapijo prav tako na pasjih mastocitomih.

V protokolu, ki ga bomo pripravili, bo elektrogenska terapija predvidena kot adjuvantna terapija k uveljavljeni terapiji, kirurgiji. V študijo bomo vključili pse s kožnimi in oralnimi tumorji. Glede na izbrano terapijo bodo psi razdeljeni v dve skupini. Če bo kirurško zdravljenje možno, bo lastnikom ponujeno in tako bodo v prvi skupini psi, pri katerih se bo izvajalo kirurško zdravljenje, ki mu bo sledila elektrogenska terapija. Če pa kirurško zdravljenje ne bo možno ali pa ga bo lastnik psa zavrnil, bodo psi razvrščeni v drugo skupino, kjer bo terapija izbora elektrogenska terapija. Študija bo tako sestavljena iz dveh protokolov: kirurškega, ki mu bo sledila elektrogenska terapija ali sama elektrogenska terapija. V obeh primerih bo aplikacija električnih pulzov potekala pod splošno anestezijo. V študijo bo vključenih do 100 psov.

Pričakovani rezultati: Pripravljena protokola za klinično študijo.

Naloga 3.2. Priprava ocene tveganje (Meseci: 12-15) (Partnerji: OI, UL VF)

Cilj: Pripraviti oceno tveganja za namerno sproščanje gensko spremenjenih organizmov (GSO) v okolje.

Opis: Ocena tveganja bo napisana v skladu s Pravilnikom o oceni tveganja za namerno sproščanje gensko spremenjenih organizmov v okolje (Uradni list RS 23/05). V skladu z zakonodajo v RS je potrebno klinično študijo, v kateri se uporabljajo GSO, prijaviti tudi na Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo Ministrstva za okolje in prostor. Plazmidna DNA, ki jo bomo uporabili v študiji kot taka sicer ni GSO, vendar pa je zaradi uporabe GSO bakterij tekom priprave plazmide DNA in možnosti horizontalnega prenosa plazmida v bakterije prisotne na koži psov, prijava študije potrebna. Poleg prijave kliničnega protokola je potrebno pripraviti in prijaviti tudi oceno tveganja za izvajanje klinične študije. Obsegala bo analizo značilnosti GSO, kjer bomo opisali značilnosti starševskega in prejemnega organizma, gensko spremembo, sestavne dele in lastnosti novonastalega organizma. Opisali bomo način in obseg namernega sproščanja v okolje ter opisali predvideno prejemno okolje. Ovrednostili bomo možne vplive nameravanega sproščanja GSO v okolje in raven tveganja za okolje in zdravje ljudi.

Pričakovani rezultati: Pripravljena ocena tveganja in oddana na Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo Ministrstva za okolje in prostor skupaj s kliničnim protokolom.

Naloga 3.3. Prijava klinične študije na pristojne organe (Meseci: 15-24) (Partnerji: OI, UL VF)

Cilj: Prijaviti klinično študijo na pristojne organe.

Opis: Dosedanje klinične študije na psih, ki so vključevale gensko terapijo, so bile zasnovane kot samostojne in so nudile gensko terapijo kot edino terapijo. Naša študija bo prva, kjer bomo gensko terapijo uporabili kombinirano s kirurgijo. V skladu z Zakonom o zaščiti živali (Uradni list RS 43/2007) bomo klinično študijo prijavili na Etično komisijo za poskuse na živalih Uprave republike Slovenije za varno hrano, veterinarstvo in varnost rastlin Ministrstva za kemtijstvo in okolje RS. V prijavi klinične študije bomo predstavili kratek pregled področja genskega elektroprenosa. Poleg tega bomo opisali nedavno opravljene študije, ki so povezane z našim področjem raziskovanja. Prikazali bomo smotrnost študije in problem kožnih in oralnih tumorjev pri psih. Opisana bo protitumorska učinkovitost IL-12 in lastnosti plazmida, ki je predviden za uporabo v študiji. Predstavljeni bodo glavni in sekundarni cilji klinične študije in plan študije skupaj z uvrstitvenimi in izključitvenimi kriteriji ter preiskavami in testi, ki se bodo opravljali pred in tekom zdravljenja. Prijava klinične študije bo obsegala tudi protokol zdravljenja (Naloga 1) in način ocenjevanja učinkovitosti študije, ki bo zajemal oceno učinkovitosti protitumorske terapije po kriterijih RECIST in/ali po WHO klasifikaciji ter načine ovrednotenja varnosti in toksičnosti (merjenje residualne prisotnosti plazmida na koži psov).

Pričakovani rezultati: Prijava klinične študije na pristojne organe.

DOGNANJA:

D 3.1: Priprava protokola klinične študije za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih.

D 3.2: Priprava ocene tveganja za izvajanje klinične študije

D 3.3: Prijava klinične študije na Etično komisijo za poskuse na živalih Uprave republike Slovenije za varno hrano, veterinarstvo in varnost rastlin in Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo Ministrstva za kmetijstvo in okolje RS.

MEJNIK

Mejnik 4:  Pridobitev dovoljenj za izvajanje klinične študije za zdravljenje kožnih in oralnih tumorjev pri psih.

DS 4: IZVAJANJE KLINIČNE ŠTUDIJE ADJUVANTNE ELEKTROGENSKE TERAPIJE Z IL-12 PRI ORALNIH IN KOŽNIH TUMORJIH PSOV

V zadnjem delovnem sklopu se bomo posvetili začetku klinične študije. Uskladili bomo delo na Onkološkem Inštitutu Ljubljana ter Kliniki za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani. Začelo se bo vključevanje psov glede na vključitvene kriterije.

Naloga 4.1: Začetek in izvajanje klinične študije (Meseci: 24-36) (Partnerji: OI, UL VF)

Cilj: Izpolniti vse pogoje, da se bo klinična študija lahko začela.

Opis: Klinično študijo bomo pričeli po validaciji plazmidov iz DS 2. Plazmid se bo pripravljal na Onkološkem Inštitutu Ljubljana in bo tam tudi shranjen do uporabe. Na dan uporabe se bo prenesel na Kliniko za kirurgijo in male živali Veterinarske fakultete Univerze v Ljubljani.

Vključevati bomo začeli pse, ki bodo imeli kožne ali oralne tumorje. Pse bomo razdelili na skupine glede na tip zdravljenja. Lastnike psov bomo seznanili s pomenom študije in potekom zdravljenja. Od njih bomo prav tako pridobili soglasje, v katerem se strinjajo z udeležitvijo psa v klinični študiji. Sprotno bomo ovrednotili rezultate klinične študije.

Pričakovani rezultati: Začetek in izvajanje klinične študije.

DOGNANJA:

D 4.1: Začetek izvajanja klinične študije.

• Bibliografski kazalci
• ČEMAŽAR, Maja, AMBROŽIČ, Jerneja, PAVLIN, Darja, SERŠA, Gregor, POLI, Alessandro, KRHAČ LEVAČIĆ, Ana, TEŠIĆ, Nataša, LAMPREHT TRATAR, Urša, RAK, Mitja, TOZON, Nataša. Efficacy and safety of electrochemotherapy combined with peritumoral IL-12 gene electrotransfer of canine mast cell tumours. Veterinary and comparative oncology, ISSN 1476-5810, Jun. 2017, vol. 15, iss. 2, str. 641-654, doi: 10.1111/vco.12208.
• TOZON, Nataša, LAMPREHT TRATAR, Urša, ŽNIDAR, Katarina, SERŠA, Gregor, TEISSIE, Justin, ČEMAŽAR, Maja. Operating procedures of the electrochemotherapy for treatment of tumor in dogs and cats. Journal of visualized experiments, ISSN 1940-087X, Oct. 2016, iss. 116.  www.jove.com/video/54760/operating-procedures-electrochemotherapy-for-treatment-tumor-dogs, doi: 10.3791/54760.
• ČEMAŽAR, Maja, LAMPREHT TRATAR, Urša, MILEVOJ, Nina, PAVLIN, Darja, NEMEC, Ana, ŽNIDAR, Katarina, SERŠA, Gregor, BROŽIČ, Andreja, TOMŠIČ, Katarina, TOZON, Nataša. Treatment of client-owned dogs with different types of tumors with electrochemotherapy in combination with canine IL-12 gene electrotransfer. V: Programme and book of abstracts, 2nd World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies incorporating Bioelectrics 2017 - The 14th International Bioelectrics Symposium, Norfolk, September 24 to 28, 2017. Norfolk: [s. n.]. 2017, str. 60-61. [COBISS.SI-ID 2752635]
• LAMPREHT TRATAR, Urša, KAMENŠEK, Urška, SAVARIN, Monika, SERŠA, Gregor, TOZON, Nataša, BOŠNJAK, Maša, BROŽIČ, Andreja, OLIVEIRA, Geraldo Gileno de Sá, NAKAGAWA, Takayuki, SAEKI, Kohei, ČEMAŽAR, Maja. Gene electrotransfer of canine interleukin 12 into canine melanoma cell lines. The journal of membrane biology, ISSN 0022-2631, 2015, vol. 248, iss. 5, str. 909-917, doi: 10.1007/s00232-015-9800-2.
• LAMPREHT TRATAR, Urša, KAMENŠEK, Urška, SAVARIN, Monika, BOŠNJAK, Maša, KRANJC, Simona, SERŠA, Gregor, ČEMAŽAR, Maja. In vitro and in vivo evaluation of a plasmid encoding canine interleukin 12. V: JARM, Tomaž (ur.), KRAMAR, Peter (ur.). 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies (WC 2015) : Portorož, Slovenia, September 6-10, 2015, (IFMBE proceedings, ISSN 1680-0737, vol. 53). Singapore: Springer. cop. 2016, str. 441-444. [COBISS.SI-ID 2103163]
• SALVADORI, Claudia, ŠVARA, Tanja, ROCCHIGIANI, Guido, MILLANTA, Francesca, PAVLIN, Darja, ČEMAŽAR, Maja, LAMPREHT TRATAR, Urša, SERŠA, Gregor, TOZON, Nataša, POLI, Alessandro. Effects of electrochemotherapy with cisplatin and peritumoral IL-12 gene electrotransfer on canine mast cell tumors : a histopathologic and immunohistochemical study. Radiology and oncology, ISSN 1318-2099. [Print ed.], 2017, vol. 50, no. 3, str. 286-294, doi: 10.1515/raon-2017-0035.
• LAMPREHT TRATAR, Urša, LOIACONO, Luisa, ČEMAŽAR, Maja, KAMENŠEK, Urška, FAZIO, Vito Michele, SERŠA, Gregor, SIGNORI, Emanuella. Gene electrotransfer of plasmid-encoding IL-12 recruits the M1 macrophages and antigen-presenting cells inducing the eradication of aggressive B16F10 murine melanoma. Mediators of inflammation, ISSN 0962-9351, May 2017, vol. 2017, str. [1-11].  www.hindawi.com/journals/mi/2017/5285890/, doi: 10.1155/2017/5285890.
• LAMPREHT TRATAR, Urša, KOS, Špela, KAMENŠEK, Urška, OTA, Maja, TOZON, Nataša, SERŠA, Gregor, ČEMAŽAR, Maja. Antitumor effect of antibiotic resistance gene-free plasmids encoding interleukin-12 in canine melanoma model. Cancer gene therapy, ISSN 0929-1903. [Print ed.], 2018, vol. , no. , str. [1-10], doi: 10.1038/s41417-018-0014-5.