FINANCIRANJE: Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS)

Vsebinski opis projekta

Radioterapija je eden izmed najbolj pogostih načinov zdravljenja, ki ima visoko protitumorsko učinkovitost. Ionizacija, ki jo sproži sevanje povzroči cepitev kemijskih vezi in oksidacijo molekul v obsevanih celicah. Najpomembnejši učinek sevanja v celicah so enojni in dvojni prelomi DNA vijačnice, ki lahko vodijo v celično smrt, mutacije ali karcinogenezo. Poleg obsevanih celic so spremembe opazne tudi v neobsevanih celicah, ki se nahajajo v bližini obsevanih celic. Pojav označujemo z izrazom učinek »bystander« (posredovani učinki sevanja), nastal pa naj bi zaradi prejemanja signalov iz sosednjih, obsevanih celic. Pomen učinka »bystander« na področju radioterapije vse bolj narašča. Deloma zaradi potenciacije lokalnega protitumorskega delovanja, deloma pa, ker lahko poveča možnost poškodb normalnega, okoliškega tkiva. Poleg lokalnega protitumorskega delovanja, lahko vpliva tudi na rast oddaljenih, nezdravljenih tumorjev, preko aktivacije imunskega sistema, kar označujemo z izrazom učinek »abscopal« (remisija oddaljenih ne-tretiranih metastaz). Učinek »bystander« še ni povsem pojasnjen in potrebuje še dodatne raziskave. Poleg že znanih mehanizmov, je lahko v učinek »bystander« vpleteno tudi povišano izražanje DNA senzorjev. Poraja se vprašanje ali lahko umirajoče tumorske celice aktivirajo sosednje tumorske celice s sproščanjem svoje DNA preko DNA senzorjev in povzročijo učinek »bystander«. Drug način bi bil aktivacija imunskih celic v tumorju, ki bi se na enak način aktivirale preko DNA senzorjev in povzročile učinek »bystander« na sosednje tumorske celice ali učinek »abscopal« na oddaljene tumorje. Cilj predlaganega projekta je poiskati odgovore na zastavljena vprašanja. Povišano izražanje DNA senzorjev lahko aktivira imunski odziv v tumorjih in pripomore k učinku obsevanja »bystander« in »abscopal«. Nekaj raziskav je že bilo narejenih na tem področju na imunskih celicah, vendar še niso ovrednotile povišanja izražanja mreže DNA senzorjev. To je glavni namen naše raziskave, ki jo bomo razširili na raziskovanje DNA senzorjev tudi v tumorskih celicah. Če se tumorske celice aktivirajo, lahko pripomorejo k učinku »bystander« z direktnim citotoksičnim učinkom ali aktivirajo citokine v imunskih celicah in s tem pripomorejo k imunskem odzivu v tumorjih. Poskusili bomo tudi prepoznati transportne mehanizme fragmentov DNA med celicami.

Faze projekta in njihova realizacija

DS 1 Ovrednotenje senzorjev DNA v učinku »bystander« po obsevanju

V tem delovnem sklopu  bomo opazovali vpletenost povečanega izražanje senzorjev DNA pri z obsevanjem povzročenim učinkom »bystander«. Zaradi možnosti primerjave in dopolnjevanja rezultatov z obstoječim projektom, financiranim s strani Ameriških nacionalnih inštitutov za zdravstvo (U.S. National Institutes of Health (NIH)) (Št. projekta: 1R01CA196796-01A1) z naslovom “DNA-specific pattern recognition receptor activation following DNA electroporation“ pri katerem preučujemo aktivacijo senzorjev DNA po genskem elektroprenosu,  bomo uporabili celično linijo mišjega melanoma B16F10. Učinek »bystander« bomo določili na osnovi preživetja celic. S pomočjo kvantitativnega PCR v realnem času (qPCR)  direktno obsevanih in neobsevanih celicah po menjavi gojišča bomo določali vrsto senzorjev DNA, ki zajema senzorje TLR9, RIG-1, DDX60, DHX9, DHX36, AIM, cGAS, DAI, DDX41, LRRFIP1, p202, p204, STING, MRE11, Ku70 in druge. Uporabili bomo različne doze sevanja in časovne termine po obsevanju. Kot posledico povečanega izražanja znotrajceličnih senzorjev DNA bomo določali tudi indukcijo citokinov (IFN tipa I in IL-1β) v obsevanih celicah in v neobsevanih celicah izpostavljenih gojišču obsevanih celic. Naši preliminarni rezultati kažejo prisoten učinek »bystander« 24 ur po prenosu medija (Slika 1A) in dozno odvisno povišanje izražanja senzorja DNA DAI (Slika 1B). Te rezultati so obetajoči in kažejo na dobro izvedljivost predlaganega projekta.
 
Naloga je delno realizirana.

Specifična naloga 1.1. Ovrednotenje učinka »bystander« z določitvijo preživetja neobsevanih celic z metodo prenosa celičnega medija. 
Uporabili bomo medij tumorskih celic, ki so bile obsevane pri različnih dozah in časovnih intervalih po obsevanju. Preverili bomo tudi preživetje direktno obsevanih celic.
Cilji: Oceniti preživetje neobsevanih tumorskih celic po dodatku gojišča obsevanih celic (metoda prenosa gojišča) in preživetje obsevanih celic v času odvzema gojišča in dolgoročno (radiosenzitivnost tumorskih celic).
Opis: Celice bomo obsevali z različnimi dozami (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in inkubirali za 5, 24 ali 48 ur. Po dodatku gojišča obsevanih celic neobsevanim celicam bomo za določitev preživetje neobsevanih celic naredili test klonogenosti (učinek »bystander«). Radiosenzitivnost celic bomo določili s testom klonogenosti ali s štetjem na hemocitometru.
Pričakovani rezultati: Določitev preživetje celic po obsevanju in učinka »bystander« in vitro glede na obsevalno dozo in časovni interval pred odvzemom gojišča.

Specifična naloga 1.2. Določevanje izražanja senzorjev DNA s kvantitativnim PCR v realnem času v obsevanih tumorskih celicah in neobsevanih tumorskih celicah, ki bodo izpostavljene mediju obsevanih celic.
Cilji: Ugotoviti, ali pride v obsevanih tumorskih celicah in v neobsevanih tumorskih celicah, ki so izpostavljeni mediju obsevanih celic do povečanega izražanja senzorjev DNA, kot možnega odziva na poškodbe, kar bi lahko bil mehanizem učinka »bystander«.
Opis: Za določitev odziva na poškodbe v obsevanih celicah, bodo celice obsevane z različnimi dozami sevanja (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in nato inkubirane različne časovne intervale (5, 24, 48 in 72 ur) pred izolacijo RNA in poznejše analize qPCR več senzorjev DNA. Za določitev s sevanjem povzročenega učinka »bystander« bodo celice obsevane z različnimi dozami sevanja (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in nato inkubirane  različni časovni interval preden bomo odvzeli gojišče in ga dodali neobsevanim celicam (5, 24 in 48 ur). Za ugotavljanje povečanega izražanja senzorjev DNA bomo po prenosu gojišča neobsevane celice inkubirali v različnih časovnih intervalih pred izolacijo RNA in analizo senzorjev DNA s qPCR.
Pričakovani rezultati: Določitev povečanega izražanja senzorjev DNA v obsevanih celicah in v neobsevanih celicah, izpostavljenih gojišču obsevanih celic, s čimer bomo pokazali vpletenost senzorjev DNA pri učinku »bystander«.

Specifična naloga 1.3. Indukcija citokinov (IFN tipa I in IL1β) v obsevanih tumorskih celicah in neobsevanih tumorskih celicah, ki bodo izpostavljene gojišču obsevanih celic, ki so rezultat povišanega izražanja znotrajceličnih senzorjev DNA.
Cilji: Določiti indukcijo citokinov (IFN tipa I in IL1β) v obsevanih tumorskih celicah in neobsevanih tumorskih celicah, ki bodo izpostavljene mediju obsevanih celic.
Opis: Obsevane in neobsevane celice, izpostavljene gojišču obsevanih celic bomo inkubirali različne časovne intervale, temelječe na rezultatih povišanega izražanja senzorjev DNA (specifična naloga 1.2.) Sledi določitev  IFN tipa I in IL1β na ravni proteinov s pomočjo pretočne citometrije. Doze obsevanja in časovni intervali bodo enaki, kot je opisano v specifični nalogi 1.2.
Pričakovani rezultati: Določitev indukcije citokinov (IFN tipa I in IL1β) v obsevanih tumorskih celicah in neobsevanih tumorskih celicah, izpostavljenih gojišču obsevanih celic, ki so rezultat povišanega izražanja znotrajceličnih senzorjev DNA.


DS 2 Ovrednotenje senzorjev DNA v učinku »abscopal« po obsevanju

V tem delovnem sklopu bomo raziskovali interakcijo med tumorskimi in imunskimi celicami kot in vitro simulacije učinka »abscopal« preko indukcije izražanja senzorjev DNA v imunskih celicah. Uporabili bomo mišje dendritične celice ali makrofage, ki so makrofagi in naj bi privzeli sproščeno DNA. So tudi proizvajalci IFN tipa I.
Obsevali bomo tumorske celice in spremljali povišano izražanje senzorjev DNA in citokinov (IFN tipa I in IL1β) po izpostavitvi imunskih celic gojišču obsevanih celic in po dodatku imunskih celic k obsevanim tumorskim celicam (ko-kultura). S tem nam bo omogočeno spremljanje interakcije med tumorskimi in imunskimi celicami v simuliranem mikrookolju tumorja. Ločili bomo aktivacijo imunskih celic preko privzema iz obsevanih celic sproščene DNA od možnega privzema fragmentov DNA skupaj z umirajočimi celicami (fagocitoza). Torej bomo ugotavljali ali so lahko imunske celice aktivirane preko privzema fragmentov proste DNA ali morajo biti za aktivacijo imunskih celic prisotni tudi tumorski antigeni iz umirajočih tumorskih celic. Spremljali bomo izražanje različnih senzorjev DNA, med drugim TLR9, RIG-1, DDX60, DHX9, DHX36, AIM, cGAS, DAI, DDX41, LRRFIP1, p202, p204, STING, MRE11, Ku70 in drugih. Uporabili bomo različne časovne interval in doze obsevanja. Določili bomo tudi indukcijo citokinov (IFN tipa I in IL1β) v imunskih celicah kot rezultat povečanega izražanja znotrajceličnih senzorjev DNA. Kot simulacijo učinka »abscopal« bomo spremljali preživetje neobsevanih tumorskih celic po dodatku imunskih celic, ki so bile pred tem aktivirane v ko-kulturi z obsevanimi tumorskimi celicami. Aktivirane imunske celicepo stimulaciji senzorjev DNA proizvajajo IFN tipa I, kar ima lahko preko inhibicije proliferacije, diferenciacije in migracije direkten učinek na tumorske celice. Zato lahko pričakujemo učinek »abscopal« tudi v odsotnosti celic T.

Specifična naloga 2.1. Izražanje senzorjev DNA in citokinov v neobsevanih imunskih celicah, ki bodo izpostavljene mediju obsevanih tumorskih celic za določanje vpliva sproščanja in privzema nukleinskih kislin iz obsevanih celic pri sprožitvi učinka »abscopal«.
Cilji: Določitev izražanja senzorjev DNA in citokinov v neobsevanih imunskih celicah.
Opis: Z različnimi dozami bomo obsevali tumorske celice (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in jim nato po različnem času (5, 24 in 48 h) odvzeli gojišče ter ga dodali neobsevanim imunskim celicami. Nato bomo izolorali RNA in izvedli analizo izražanja senzorjev DNA s qPCR. Na proteinski ravni bomo s pretočno citometrijo spremljali bomo tudi izločanje citokinov (IFN tipa I in IL1β).
Pričakovani rezultati: Določitev povečanega izražanja senzorjev DNA in citokinv v neobsevanih imunskih celicah, izpostavljenih gojišču obsevanih tumorskih celic zaradi mogočega prispevanja nukleninskih kislin pri sprožanju učinka »abscopal«.

Specifična naloga 2.2. Izražanje senzorjev DNA in citokinov v ko-kulturi obsevanih tumorskih celic in neobsevanih imunskih celic za ugotovitev ali imunske celice s fagocitozo  delcev mrtvih tumorskih celic pripomorejo k učinku »abscopal«.
Cilji: Določiti izražanje senzorjev DNA in citokinov (IFN tipa I in IL1β) v neobsevanih imunskih celicah rastočih v ko-kulturi z obsevanimi tumorskimi celicami.
Opis: Z različnimi dozami bomo obsevali tumorske celice (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in jih nato dodali v ko-kulturo z imunskimi celicami. Preverili bomo različna razmerja med imunskimi in tumorskimi celicami. Celice bodo inkubirane različne časovne termine. Imunske celice bomo nato ločili od tumorskih ter očistili na podlagi antigena skupnega levkocitom (CD45). Sledila bo izolacija RNA in analiza izražanja senzorjev DNA z uporabo qPCR. Na proteinski ravni bomo s pretočno citometrijo preverili tudi izločanje IFN tipa I in IL1β.
Pričakovani rezultati: Določitev povečanega izražanja senzorjev DNA in citokinov (IFN tipa I in IL1β) v neobsevanih imunskih celicah rastočih v ko-kulturi z obsevanimi tumorskimi celicami zaradi mogočega prispevanja privzema DNA s fagocitozo pri sprožanju učinka »abscopal«.

Specifična naloga 2.3. Ovrednotenje učinka »abscopal« v ko-kulturi tumorskih in imunskih celic. Določevanje preživetja neobsevanih tumorskih celic po dodatku »aktiviranih« imunskih celic.
Cilji: Oceniti učinek »abscopal« v ko-kulturi tumorskih in imunskih celic z določevanjem preživetja neobsevanih tumorskih celic po dodatku aktiviranih imunskih celic.
Opis: Obsevanje in ko-kultiviranje bo potekalo kot v nalogi 2.2. Po ločitvi aktiviranih imunskih celic od obsevanih tumorskih celic bomo imunske celice dodali neobsevanim tumorskim celicam in spremljali njihovo preživetje s testom klonogenosti.
Pričakovani rezultati: Določitev učinka »abscopal«, kar kaže na citotoksično delovanje citokinov sproščenih iz imunskih celic po povečanem izražanju senzorjev DNA.

DS 3 Raziskovanje mehanizma transporta DNA iz obsevanih celic, ki sproži učinek »bystander« in »abscopal« v sosednjih celicah.

V tem delovnem sklopu bomo raziskovali kako je DNA transportirana iz obsevanih do neobsevanih sosednjih celic. Opazovali bomo dve možnosti: sproščanje fragmentov DNA, zapakiranih v mikrovezikle ali sproščanje fragmentov DNA v celično gojišče. Tumorske celice bodo obsevane in v gojišču bomo s pretočno citometrijo analizirali prisotnost mikroveziklov (velikosti do 500 nm) ali z gelsko elektroforezo proste fragmente DNA.

Specifična naloga 3.1. Določitev prisotnosti mikroveziklov v celičnem mediju obsevanih tumorskih celic s pretočno citometrijo.
Cilji: Določiti prisotnost mikroveziklov v celičnem gojišču obsevanih celic v različnih časovnih terminih po obsevanju.
Opis: Tumorske celice bomo obsevali z različnimi dozami (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in jim nato po različnem času (5, 24 in 48 h) odvzeli gojišče ter s pretočnim citometrom izmerili mikrovezikle v gojišču.
Pričakovani rezultati: Določitev mikroveziklov v gojišču obsevanih celic, kar bo osvetlilo mehanizem transporta DNA, ki sodeluje pri sprožitvi učinkov »bystander« in » abscopal«.

Naloga je delno realizirana.

Specifična naloga 3.2. Določitev fragmentov DNA v celičnem mediju obsevanih tumorskih celic in njihova karakterizacija z gelsko elektroforezo.
Cilji: Določiti prisotnost fragmentov DNA v gojišču obsevanih tumorskih celic in njihova karakterizacija z gelsko elektroforezo v različnih časovnih terminih po obsevanju.
Opis: Tumorske celice bomo obsevali z različnimi dozami (0,5 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) in jim nato po različnem času (5, 24 in 48 h) odvzeli gojišče. DNA bo očiščena in velikost fragmentov DNA bo karakterizirana z uporabo gelske elektroforeze.
Pričakovani rezultati: Določitev fragmentov DNA v gojišču obsevanih celic, kar bo osvetlilo mehanizem transporta DNA, ki sodeluje pri sprožitvi učinkov »bystander« in » abscopal«.


Bibliografski kazalci