Preprečevanje rezistence tumorskih celic na antiproteazno terapijo z inhibitorji katepsina X

Povzetek

Napredovanje malignih bolezni je povezano s prekomernim delovanjem proteoliznih encimov. Ti so udeleženi v vrsti procesov, ki omogočajo rast tumorjev, njihovo ožiljanje, migracijo in invazijo tumorskih celic in tvorbo metastaz. Med ključne proteolizne encime, povezane z malignimi procesi, sodijo cisteinski katepsini, ki se v normalnih celicah nahajajo predvsem v endosomih in lizosomih in so odgovorni za znotrajcelični katabolizem proteinov. V tumorskih celicah pa se katepsini prenesejo na celične membrane ali izločajo iz celic ter vstopajo v tumorsko proteolizno kaskado.  Kot najpomembnejši tumorski promotor se je izkazal katepsin B, ki v lizosomih deluje predvsem kot eksopeptidaza in je udeležen v normalnem proteinskem katabolizmu in avtofagiji, v tumorskem okolju pa katepsin B močno poveča endopeptidazno aktivnost, ki je odgovorna za razgradnjo zunajceličnega matriksa. Do te spremembe pride zaradi konformacijskega preklopa, ki je posledica fleksibilne strukturne enote, imenovane zaporna zanka, ki regulira vstop proteinskih substratov v aktivno mesto. Katepsin B je nadizražen v praktično vseh vrstah tumorjev, inhibicija njegovega izražanja ali pa endopeptidazne proteolizne aktivnosti pa se kaže v bistveno zmanjšani tumorski rasti in metastaziranju. V zadnjem času je bila razvita vrsta specifičnih inhibitorjev katepsina B, ki so postali kandidati za klinična testiranja.  Žal se je izkazalo, da se s časom učinkovitost teh inhibitorjev zmanjša, saj tumorske celice razvijejo rezistenco napram terapiji, usmerjeni proti katepsinu B. Ugotovili smo, da je glavni dejavnik te rezistence katepsinu B podoben katepsin X. Tudi ta encim deluje kot karboksipeptidaza, v tumorjih pa ne razvije endopeptidazne aktivnosti in ne razgrajuje zunajceličnega matriksa, pospešuje pa tumorsko migracijo in invazijo z alternativnimi mehanizmi, predvsem preko regulacije integrinskih receptorjev in tumorskega supresorja profilina 1. Njegovo povečano izražanje in aktivnost sta torej povezani z obnovljeno sposobnostjo tumorskih celic da migrirajo in invadirajo, čeprav to pot brez razgradnje zunajceličnega matriksa.

Naša hipoteza je da lahko inhibitorji katepsina X bistveno zmanjšajo rezistenco tumorskih celic na antiproteazno terapijo, usmerjeno protu delovanju katepsina B. V ta namen nameravamo pripraviti inhibitorje katepsina X, ki bodo i) majhne molekule z reverzibilno in tesno vezavo, ii) selektivni za katepsin X, iii)  vodotopni in netoksični za sesalčje celice. Nove spojine bodo pripravljene s pomočjo strukturno podprtega načrtovanja zdravil, pri čemer bomo uporabili virtualno rešetanje knjižnic spojin, encimsko kinetiko in usmerjeno sintezo. Strukture z najboljšim prileganjem aktivnemu mestu katepsina X bodo sintetizirane, očiščene in okarakterizirane. Pripravili bomo tudi formulacije, ki bodo primerne za njihovo nadaljnje testiranje in vitro in in vivo. Spojine bomo testirali v in vitro modelih tumorske adhezije, migracije, invazije in angiogeneze, ki bodo posnemali patološke procese napredovanja raka, ki smo jih predhodno razvili v naših laboratorijih. Izbrane inhibitorje katepsina X bomo testirali in vivo na mišjih modelih tumorske rasti in metastaziranja, ki so bili razviti v naših laboratorijih za testiranje učinkovitosti inhibitorjev katepsina B in drugih cisteinskih proteaz. Tako bomo uporabili C57Bl/6 miši in LPB-1 tumorske celice v modelu mišjega fibrosarkoma in FVB/N miši in njihovo transgeno linijo FVB/PyMT v modelu raka dojk. Določili bomo tudi signalne poti, ki privedejo do aktivacije izražanja katepsina X ob pojavu tumorske rezistence in opredelili nove tarče, katerih regulacija bi lahko dodatno izboljšala antiproteazno terapijo pri pacientih z rakom.

Naš pristop predstavlja izviren način preprečevanja rezistence tumorskih celic na obstoječe protitumorske učinkovine, omogoča njihovo hitrejšo translacijo v klinična testiranja in bolj učinkovito zdravljenje bolnikov z rakom.