Izolacija genomske DNK

Izolacija genomske DNK iz vzorcev poteka z obarjanjem in ločevanjem DNK od ostalih sestavin vzorca. Genomsko DNK izoliramo iz vzorcev krvi, kostnega mozga, punktata (aspiracijska biopsija, eksudat), tkivnih rezin v parafinu, svežega tkiva in zmrznjenega tkiva.

PCR

PCR (polymerase chain reaction) – verižna reakcija s polimerazo je tehnika, pri kateri poteka pomnoževanje izbranih delov DNK z uporabo DNK polimeraze. Specifičnost pomnoževanja zagotovimo z izbranimi značilnimi oligonukleotidnimi začetniki (primerji), ki se prilegajo specifičnemu delu DNK, ki ga želimo pomnožiti. PCR reakcija predstavlja osnovo za testiranje DNK v molekularni diagnostiki. Za pomnožitev specifičnega dela DNK uporabimo izolirano genomsko DNK.

Ločevanje molekul z gelsko elektroforezo

Nastali PCR produkt lahko analiziramo z elektroforetskimi tehnikami. Za analizo lahko uporabimo navadno elektroforezo (agarozna elektroforeza, PAGE-poliakrilamidna gelska elektroforeza) ali kapilarno gelsko elektroforezo (bioanalizator), s katerimi produkte ločimo po velikosti. Na ta način ugotavljamo ali smo dobili PCR produkt pričakovane velikosti in ali je bila reakcija specifična. V primeru kapilarne elektroforeze produkte lahko tudi kvantificiramo.

Sekvenciranje po Sangerju

S sekvenciranjem po Sangerju določimo zaporedje nukleotidov v preiskovanem fragmentu DNK. Tehnika temelji na uporabi kemijsko modificiranih fluorescenčno označenih nukleotidov, ki se vedno vežejo na koncu. Po končani sekvenčni reakciji dobimo mešanico različno dolgih fragmentov, ki jih ločimo z visoko-ločljivostno kapilarno elektroforezo. S sekvenciranjem iščemo in določamo neznane mutacije, manjše delecije in insercije v eksonih in obeksonskih regijah preiskovanih genov. Uporabljamo ga tudi za potrjevanje že znanih zarodnih mutacij ter za potrditev mutacij določenih s sekvenciranjem druge generacije..

Fragmentna analiza

S to tehniko ločimo fluorescenčno označene PCR produkte po principu kapilarne elektroforeze. Sem sodi metoda MLPA (metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond; ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), s katero zaznamo večje delecije/duplikacije v vzorcu DNK. MLPA omogoča zaznavanje večjih sprememb na DNK, ki jih z metodo direktnega sekvenciranja ne zaznamo. Fragmentna analiza nam tudi omogoča ločevanje med monoklonskimi in poliklonskimi limfoidnimi proliferacijami.

Alelna diskriminacija

Metodo alelne diskriminacije uporabljamo za genotipizacijo znanih točkovnih mutacij. Z metodo alelne diskriminacije v preiskovanem vzorcu razlikujemo med t. i. mutiranim in normalnim genotipom. Temelji na tehniki PCR v realnem času in uporabi za alel-specifičnih sond.

Kvantitativni PCR v realnem času (Q-PCR)

To so tehnike, ki omogočajo spremljanje pomnoževanja PCR produktov v realnem času (Q- PCR). Za ta namen morajo biti PCR produkti označeni s flourescentnimi barvili. Med te tehnike sodi tudi alelno specifični PCR, ki omogoča spremljanje prisotnosti (odsotnosti) znanih mutacij v izbranem genu (npr. KRAS, BRAF, NRAS).

Pirosekvenciranje

Pirosekvenciranje spada med metode, s katerimi določamo nukleotidno zaporedje v izbranih fragmentih DNK. Velja za visoko občutljivo metodo in omogoča neposredno dokazovanje mesta mutacije in vrsto mutacije. Temelji na postopku sinteznega sekvenciranja, kjer aktvinost DNA-polimeraze (vgrajevanje nukleotidov) zaznavamo s kemiluminiscentnim encimom.

Sekvenciranje druge generacije (NGS)

S sekvenciranjem druge generacije določamo nukleotidno zaporedje več miljonov fragmentov DNK hkrati. V našem laboratoriju uporabljamo sisteme Illumina MiSeq Dx, Illumina NextSeq 550 in ThermoFisher Scientific Ion Torrent Genexus Dx. Na Illumina sistemih določanje nukleotidnega zaporedja poteka na t.i. pretočni celici oz. ploščici in temelji na tehniki sekvenciranja po sintezi (sinteznega sekvenciranja). To pomeni, da se med potekom sekvenciranja v vsakem koraku (ciklu) na matrico DNK veže po en komplementaren nukleotid po principu naravne kompeticije. Vsak nukleotid ima svojo barvno kodo, ki jo aparat zazna. Aparat pridobiva podatke z zajemanjem slike v vsakem koraku, sledi pa sestavljanje in analiza dobljenih nukleotidnih zaporedij – odčitkov (angl. read) s pomočjo uporabe zmogljivih računalniških algoritmov in programov. Na ThermoFisher Scientific sistemu Genexus poteka sekvenciranje na posebnem čipu, ki deluje kot ultraobčutljiv pH meter (semikonduktor). Med samim sekvenciranjem aparat zaporedoma preplavlja čip s posameznimi nukleotidi, in ob vezavi nukleotida čip zazna sproščanje vodikovih ionov (zazna spremembo napetosti). Gre za enostavno in hitro tehnologijo, kjer je kemično kodirana informacija neposredno prevedena v digitalno informacijo.

Sekvenciranje druge generacije (NGS) nam torej omogoča analizo večjega števila genov hkrati, zaradi česar je sam postopek testiranja bolnikov hitrejši in cenejši.