OI Ljubljana
Eng

Molekularno-diagnostične tehnike

Izolacija genomske DNK
Izolacija genomske DNK iz vzorcev poteka z obarjanjem in ločevanjem DNK od ostalih sestavin vzorca. Genomsko DNK izoliramo iz vzorcev krvi, kostnega mozga, punktata (aspiracijska biopsija, eksudat), tkivnih rezin v parafinu, svežega tkiva in zmrznjenega tkiva.

PCR
PCR (polymerase chain reaction) – verižna reakcija s polimerazo je tehnika, pri kateri poteka pomnoževanje izbranih delov DNK z uporabo DNK polimeraze. Specifičnost pomnoževanja zagotovimo z izbranimi značilnimi oligonukleotidnimi začetniki (primerje), ki se prilegajo specifičnemu delu DNK, ki ga želimo pomnožiti. PCR reakcija predstavlja osnovo za testiranje DNK in RNK v molekularni diagnostiki. Za pomnožitev specifičnega dela DNK uporabimo izolirano genomsko DNK.

Ločevanje molekul z gelsko elektroforezo
Nastali PCR produkt lahko analiziramo z elektroforetskimi tehnikami. Produkt lahko z navadno elektroforezo (agarozna elektroforeza, PAGE-poliakrilamidna gelska elektroforeza) ločimo po velikosti. Na ta način ugotavljamo ali smo dobili PCR produkt pričakovane velikosti in ali je bila reakcija specifična.
Produkt lahko analiziramo z DGGE (denaturirajoča gradientna gelska elektroforeza), ki jo uporabljamo za detekcijo neznanih sprememb v DNK zaporedju. S to metodo ugotavljamo ali je v PCR produktu prisoten le en tip sekvence izbranega dela (pr. divji tip) ali pa je prisoten tudi drug tip sekvence (mutacija).

Sekvenciranje
S sekvenčno analizo določimo zaporedje nukleotidov v preiskovanem fragmentu DNK. S sekvenciranjem iščemo in določamo neznane mutacije, manjše delecije in insercije v eksonih preiskovanih genov ter potrjujemo že znane mutacije.

Fragmentna analiza
S fragmentno analizo detektiramo fluorescenčno označene monoklonske oziroma poliklonske PCR produkte. Z metodo MLPA (metoda hkratnega pomnoževanja od ligacije odvisnih sond; ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) pa zaznamo večje delecije/duplikacije v vzorcu DNK. MLPA omogoča zaznavanje večjih sprememb na DNK, ki jih z metodo direktnega sekvenciranja ne zaznamo.

Alelna diskriminacija
Metodo alelne diskriminacije uporabljamo za genotipizacijo znanih točkovnih mutacij. Z metodo alelne diskriminacije v preiskovanem vzorcu razlikujemo med t. i. mutiranim in normalnim genotipom. Temelji na tehniki PCR v realnem času in uporabi za alel-specifičnih sond.

Kvantitativni PCR v realnem času (Q-PCR)
To so tehnike, ki omogočajo spremljanje pomnoževanja PCR produktov v realnem času (Q- PCR). Za ta namen morajo biti PCR produkti označeni s flourescentnimi barvili. Med te tehnike sodi tudi metoda ločevanja fluorecentno označenih PCR produktov na osnovi talitvene krivulje - metoda HRM (High Resolution Melting).Ta tehnika omogoča spremljanje prisotnosti (odsotnosti) spremembe na DNK, detekcijo znanih mutacij, ter vrednotenje izražanja izbranega gena.

 

 

© 2018 - Onkološki inštitut Ljubljana