OI Ljubljana
Eng

Preprečevanje rezistence tumorskih celic na antiproteazno terapijo z inhibitorji katepsina X. (temeljni raziskovalni projekt)

 

Vsebinski opis projekta

Napredovanje malignih bolezni je povezano s prekomernim delovanjem proteoliznih encimov. Ti so udeleženi v vrsti procesov, ki omogočajo rast tumorjev, njihovo ožiljanje, migracijo in invazijo tumorskih celic in tvorbo metastaz. Med ključne proteolizne encime, povezane z malignimi procesi, sodijo cisteinski katepsini, ki se v normalnih celicah nahajajo predvsem v endosomih in lizosomih in so odgovorni za znotrajcelični katabolizem proteinov. V tumorskih celicah pa se katepsini prenesejo na celične membrane ali izločajo iz celic ter vstopajo v tumorsko proteolizno kaskado.  Kot najpomembnejši tumorski promotor se je izkazal katepsin B, ki v lizosomih deluje predvsem kot eksopeptidaza in je udeležen v normalnem proteinskem katabolizmu in avtofagiji, v tumorskem okolju pa katepsin B močno poveča endopeptidazno aktivnost, ki je odgovorna za razgradnjo zunajceličnega matriksa. Do te spremembe pride zaradi konformacijskega preklopa, ki je posledica fleksibilne strukturne enote, imenovane zaporna zanka, ki regulira vstop proteinskih substratov v aktivno mesto. Katepsin B je nadizražen v praktično vseh vrstah tumorjev, inhibicija njegovega izražanja ali pa endopeptidazne proteolizne aktivnosti pa se kaže v bistveno zmanjšani tumorski rasti in metastaziranju. V zadnjem času je bila razvita vrsta specifičnih inhibitorjev katepsina B, ki so postali kandidati za klinična testiranja. Žal se je izkazalo, da se s časom učinkovitost teh inhibitorjev zmanjša, saj tumorske celice razvijejo rezistenco napram terapiji, usmerjeni proti katepsinu B. Ugotovili smo, da je glavni dejavnik te rezistence katepsinu B podoben katepsin X. Tudi ta encim deluje kot karboksipeptidaza, v tumorjih pa ne razvije endopeptidazne aktivnosti in ne razgrajuje zunajceličnega matriksa, pospešuje pa tumorsko migracijo in invazijo z alternativnimi mehanizmi, predvsem preko regulacije integrinskih receptorjev in tumorskega supresorja profilina 1. Njegovo povečano izražanje in aktivnost sta torej povezani z obnovljeno sposobnostjo tumorskih celic da migrirajo in invadirajo, čeprav to pot brez razgradnje zunajceličnega matriksa. Naša hipoteza je da lahko inhibitorji katepsina X bistveno zmanjšajo rezistenco tumorskih celic na antiproteazno terapijo, usmerjeno protu delovanju katepsina B. V ta namen nameravamo pripraviti inhibitorje katepsina X, ki bodo i) majhne molekule z reverzibilno in tesno vezavo, ii) selektivni za katepsin X, iii)  vodotopni in netoksični za sesalčje celice. Nove spojine bodo pripravljene s pomočjo strukturno podprtega načrtovanja zdravil, pri čemer bomo uporabili virtualno rešetanje knjižnic spojin, encimsko kinetiko in usmerjeno sintezo. Strukture z najboljšim prileganjem aktivnemu mestu katepsina X bodo sintetizirane, očiščene in okarakterizirane. Pripravili bomo tudi formulacije, ki bodo primerne za njihovo nadaljnje testiranje in vitro in in vivo. Spojine bomo testirali v in vitro modelih tumorske adhezije, migracije, invazije in angiogeneze, ki bodo posnemali patološke procese napredovanja raka, ki smo jih predhodno razvili v naših laboratorijih. Izbrane inhibitorje katepsina X bomo testirali in vivo na mišjih modelih tumorske rasti in metastaziranja, ki so bili razviti v naših laboratorijih za testiranje učinkovitosti inhibitorjev katepsina B in drugih cisteinskih proteaz. Tako bomo uporabili C57Bl/6 miši in LPB-1 tumorske celice v modelu mišjega fibrosarkoma in FVB/N miši in njihovo transgeno linijo FVB/PyMT v modelu raka dojk.

Določili bomo tudi signalne poti, ki privedejo do aktivacije izražanja katepsina X ob pojavu tumorske rezistence in opredelili nove tarče, katerih regulacija bi lahko dodatno izboljšala antiproteazno terapijo pri pacientih z rakom. Naš pristop predstavlja izviren način preprečevanja rezistence tumorskih celic na obstoječe protitumorske učinkovine, omogoča njihovo hitrejšo translacijo v klinična testiranja in bolj učinkovito zdravljenje bolnikov z rakom.

 

Faze projekta in njihova realizacija

Glavni cilji projekta so sledeči:

Cilj 1: Razviti nove inhibitorje Kat X, ki bodo majhne molekule z reverzibilno in tesno vezavo, selektivni za Kat X, vodotopni in netoksični za sesalčje celice.

Nove spojine bodo pripravljene s pomočjo naprednih metod strukturno podprtega načrtovanja zdravil (SBDD). Te metode se uporabljajo, ko je poznana 3D struktura tarče in vključujejo dve glavni strategiji za pridobitev zadetkov ali vodilnih struktur: virtualnega visokozmogljivega rešetanja indenovo načrtovanja in sinteze. Strukture z najboljšim prileganjem aktivnemu mestu Kat X bodo sintetizirane, očiščene in okarakterizirane. Dodatno bodo inhibitorji Kat X izbrani iz knjižnic spojin, dostopnih naši skupini. Pripravili bomo tudi formulacije, ki bodo primerne za njihovo nadaljnje testiranje in vitro in in vivo.

 

Cilj 2: Dokazati, da novi inhibitorji učinkovito zavirajo tumorsko rast, invazijo, migracijo in angiogenezo v in vitro testnih modelih, bodisi sami ali v kombinaciji z znanimi inhibitorji Kat B in drugih z rakom povezanih peptidaz.

V ta namen bomo uporabili primarne in stabilne celične linije različnih izvorov, s pomočjo katerih bomo simulirali patološke procese pri rakavih bolnikih. Celice bodo gojene kot monokulture ali kot kokulture, poleg suspenzije tudi v 2D in 3D oblikah v kolagenu in Matrigelu, to je okoljih, podobnih tumorskemu tkivu. Po tretiranju s specifičnimi inhibitorji Kat X ali kombinacijo z drugimi peptidaznimi inhibitorji bomo sledili celično preživetje in podvojevanje, apoptozo, interakcije med celicami in celicami z ECM. Spremembe v celični morfologiji, izražanje različnih tumorskih kazalcev ter njihovo membransko in znotrajcelično lokalizacijo bomo določali z fluorescentno mikroskopijo, pretočno citometrijo, RT-PCR in uporabo mikromrež.

 

Cilj 3: Dokazati medsebojno povezanost Kat B in X pri raku in določitv signalizacijskih poti, ki vodijo do kompenzacijskega efekta pri anti-peptidazni protitumorski terapiji.

Celični lizati različnih tumorskih celičnih linij z zmanjšanim izražanjem ali aktivnostjo Kat B in X bodo uporabljeni za določanje znotrajceličnih in apoptoznih signalizacijskih poti z uporabo proteinskih mikromrež. Motnje v signalizacijskih poteh bomo potrdili z imunskimi metodami z uporabo pretočne citometrije in prenosa western. Mehanizem kompenzacijskega efekta, ki vodi do povišane regulacije Kat X, bomo preučevali tudi z uporabo specifičnih inhibitorjev kinaz in drugih signalnih molekul.

 

Cilj 4: Dokazati, da v in vivo modelih tumorske rasti in metastaziranja hkratna uporaba inhibitorjev Kat X poveča učinkovitost terapije in zmanjša pojav rezistence pri že uveljavljenih peptidaznih inhibitorjih, predvsem inhibitorjih Kat B.

Mišji modeli tumorigeneze in metastaziranja so lahko dober približek malignim procesom pri ljudeh, vendar lahko delujejo specifično glede na posamezno linijo in tip tumorskih celic. Zato bomo inhibitorje Kat X in kombinacije z inhibitorji Kat B testirali na različnih modelih, s čemer bomo zmanjšali možnost specifičnih odzivov. Kot prvi model bomo uporabili C57Bl/6 miši in LPB-1 tumorske celice. V drugem modelu bomo uporabili FVB/N miši in pa njihovo transgeno linijo FVB/PyMT, ki je pod kontrolo MMTV LTR promotorja (FVB/N-TgN (MMTVPyVT-634-Mul) in je sposobna spontane tvorbe metastaz. Kot tumorske celice v FVB/N modelu bomo uporabili PyMT tumorje.

 

 

 

 

© 2019 - Onkološki inštitut Ljubljana
Za slepe in slabovidne(CTRL+F2)
barva kontrasta
velikost besedila
označitev vsebine
povečava