- ŠIFRA PROJEKTA: J3-8202 (D)
- NAZIV PROJEKTA: Spremljanje imunskega odziva v realnem času po in situ vakcinaciji z elektrokemoterapijo in pridruženo gensko terapijo z interlevkinom-12 (temeljni raziskovalni projekt)
- VODJA PROJEKTA: prof. dr. Maja Čemažar
- TRAJANJE: 1. 5. 2017 - 30. 4. 2020
- SESTAVA PROJEKTNE SKUPINE
- RAZISKOVALNE ORGANIZACIJE: (1) ONKOLOŠKI INŠTITUT LJUBLJANA in (2) Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta
- FTE: 1,41 FTE
- FINANCIRANJE: Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS)
Vsebinski opis projekta
Trenutno za zdravljenje raka pridobivajo na pomenu različne lokalne ablacijske terapije, ki v bistvu lahko delujejo kot in situ vakcine, saj povzročijo sproščanje tumorskih antigenov hkrati z signali nevarnosti, kar lahko sproži nastanek endogenega imunskega protitumorskega odgovora. Pred kratkim smo objavili model, kako bi lahko uporabili elektrokemoterapijo (ECT), ki je vrsta lokalne ablacijske terapije, kot in situ vakcinacijo v kombinaciji z elektrogenskim prenosom (GET) interleukina 12, s katerim bi pospešili sprožen imunski odziv proti tumorskim antigenom sproščenim iz ubit tumorskih celic (Sersa et al., 2015). Uporabnost modela smo potrdili v klinični raziskavi na psih (Cemazar et al., 2016), ampak natančni mehanizmi opažene protitumorske učinkovitosti na nivoju vpletenosti imunskih celic še niso jasni. V odobrenem projektu bo naš cilj spremljati imunski odgovor po ECT in EGT z IL-12 ter njuni kombinaciji z intravitalnim slikanjem v realnem času, ter ga korelirati s lokalno in sistemsko inhibicijo rasti tumorjev na mišjih tumorskih modelih. Najprej bomo ovrednotili terapevtsko učinkovitost terapij s standardnimi fenomenološkimi modeli za dokazovanje lokalne in sistemske inhibicije rasti tumorjev. Nato bomo z uporabo konfokalnega mikroskopa in fluorescentnih označevalcev določili prostorsko razporeditev celičnih smrti po ECT in izražanja po EGT, kar bo pripomoglo k boljšemu razumevanju mehanizmov protitumorskega delovanja obeh terapij. Na koncu bomo imunološke dogodke v tumorju in okoliškem tkivu in tudi v limfnih vozlih poslikali po kombinirani terapiji z ECT in EGT z IL-12, s čimer bomo razložili mehanizme protitumorske učinkovitosti. Hkrati nam bojo pridobljeni rezultati v pomoč pri izboljševanju pristopa: prilagoditve doz in zaporedja časovnih intervalov terapij.
Faze projekta in njihova realizacija
Pri izvajanju projekta smo sledili zastavljenim ciljem, ki smo jih razdelili v 4 delovne sklope (DS) za obdobje 3 let. V prvem letu smo realizirali ali pa vsaj začeli realizirat vse delovne naloge (DN) znotraj 1. DS.
DS 1: Vzpostavitev sistema za slikanje imunskega sistema v realnem času z uporabo konfokalnega mikroskopa.
- DN 1.1.: Izbira modelov.
Cilj: Poiskati primerne modele za slikanje imunskega sistema, ki bodo najbolj primerni za doseganje naših ciljev.
Rezultati: Za izbiro primernih modelov smo podrobno pregledali obstoječo literaturo. Iskali smo primerne mišje modele, melanomske celične linije, tehnike za kirurško pripravo vzorcev, celične označevalce itd. Pri mišjem modelu smo se odločili za SKH1 miši, ki so brez dlak, albino in imuno kompetentne, zato so še posebej primerne za in vivo slikovne tehnike. Pri izboru tumorskega modela smo se odločili za mišji melanom, ki je singen izbranim SKH1 mišim in je tudi primeren model za študije imunoloških procesov. Glede na pregled literature smo naredili seznam primernih tehnik za kirurško izpostavitev struktur in za njihovo označevanje[1].
- DN 1.2: Optimizacija tehnik za označevanje specifičnih celičnih populacij.
Cilj: Optimizirati metode za označevanje celic za fluorescenčno slikanje v realnem času.
Rezultati: Za vizualizacijo tumorskih celic smo izbrali celice stabilno transferirane z reporterskim genom za zeleni fluorescentni protein in rdeči fluorescentni protein tomato. Za označevanje specifičnih populacij celic smo optimizirali in ovrednotili dve metodi, eno za in situ označevanje in en za ex vivo označevanje. Pri metodi za in situ označevanje smo testirali označevanje s konjugiranimi fluorescentnimi protitelesi, izbrali smo protitelo za kalretikulin, ki je eden izmed signalov nevarnosti pri imunogeni obliki celične smrti. Ex vivo metode pa temeljijo na izolaciji in ločevanju specifičnih celičnih populacij iz donorskih živali, označevanju slednjih celic s fluorescenčnimi celičnimi označevalci in prenosu v prejemno žival. Mi smo izolirali splenocite iz vranice žrtvovanih živali ter jih v celični kulturi ex vivo označili z nespecifičnim fluorescentnim označevalcem CFSE. Označene celice smo potem injicirali v repno veno in v orbitalni sinus. Poleg tega smo za označevanje krvi testirali dekstrane, ter za označevanje mrtvih celic propidijev jodid [1, 2].
- DN 1.3: Optimizacija tehnik za kirurško pripravo in fiksacijo različnih struktur.
Cilj: Optimizirati in obvladati tehnike za kirurško pripravo tumorjev vključno s kožo ob tumorju in ingvinalnimi limfnimi vozli
Rezultati: Za slikanje tumorja in kože ob tumorju smo optimizirali metodo dorzalnega okna. Metoda je bila že predhodno optimizirana v našem laboratoriju, in sicer za sledenje protižilne učinkovitosti različnih terapij. Za tekoči projekt smo jo modificirali za slikanje pod konfokalnim mikroskopom. Optimizirali smo tudi tehniko za izpostavitev limfnih vozlov pri živih živalih ter jih prilagodili v skladu s potrebo in opremo. Posebno pozornost smo posvetili konstrukciji nosilcev za stabilizacijo vidnega polja pod konfokalnim mikroskopom [1].
- DN 1.4: Določanje imunske sestave v tumorju kontrolnih nezdravljenih miši.
Cilj: Slediti in slikati dogodke imunskega sistema v tumorju, ob tumorju in v ingvinalnem limfnem vozlu pred terapijo.
Rezultati: S pomočjo izbranih modelov in optimiziranih tehnik smo ovrednotili infiltracijo imunskih celic in njihov kontakt s tumorskimi ali stromalnimi celicami v tumorju in koži ob tumorju v dorzalnem oknu [2, 3].
V referenčnem obdobju smo tudi že začeli z realizacijo nekaterih delovnih sklopov, ki so bili planirani za 2. leto tekočega projekta.
DS 2: Določanje protitumorske učinkovitosti in učinka na oddaljene tumorje pri miši s tumorjem
- DN 2.1. Lokalni in sistemski zaostanek v rasti tumorjev po ECT in GET.
Cilj: Določiti lokalni in sistemski (angl. »abscopal«) zaostanek v rasti tumorjev po ECT in GET.
Rezultati: V tem sklopu poskusov smo uporabili standardni model induciranih subkutanih tumorjev. Zaenkrat smo naredili primerjavo učinkovitosti elektrokemoterapije (ECT) z dvema kemoterapevtikoma oksaliplatinom (OXA) in cisplatinom (CDDP). Namreč, poleg CDDP, ki se že uporablja za ECT, se za zdravljenje raka pogosto uporablja tudi OXA. Na podlagi lastnosti OXA, ki so podobne CDDP, in poudarjene imunomodulatorne vloge je OXA kandidat za elektrokemoterapijo. Z namenom določitve doze OXA, ki vodi do primerljivega protitumorskega učinka kot CDDP, smo v raziskavi primerjali učinkovitost intratumoralne ECT z OXA in ECT s CDDP na mišjem malignem melanomu B16F10. Rezultati so pakazali, da je OXA citostatik na bazi platine, ki je primeren za uporabo v ECT. Učinkovitost EKT z OXA je primerljiva ECT s CDDP [3]. Terapevtsko učinkovitost smo dokazali tudi po genskem elektroprenosu (GET) različnih plazmidov v tumorje melanoma, med drugim tudi po GET plazmida za interlevkin 12 [4, 5, 6].
- DN 2.2: Imunohistokemijsko ovrednotenje imunskega odgovora.
Cilj: Okarakterizirati tip izzvanega imunskega odgovora z imunohistokemijsko evaluacijo.
Rezultati: V zgoraj opisani raziskavi primerjave OXA in CDDP za uporabo v ECT, smo tudi določali indukcijo imunksega odziva po ECT z obema kemoterapevtikoma. In vitro smo določali vrsto celične smrti in izpostavitev kalretikulina, ki je eden izmed kazalcev imunogene celične smrti. Izpostavitev smo pokazali tudi in vivo na modelu dorzalnega okna. V isti študiji smo naredili tudi histološko analizo tretiranih tumorjev: gledali smo infiltracijo efektorskih imunskih celic, ter področja nekroze in apoptoze, ter pokazali, da oba terapevtka vzpodbudita enak imunski odziv [3]. Indukcijo imunskega odgovora po transfekciji v melanomske tumorje pa smo dokazali tudi po GET različnih plazmidov, med drugim tudi plazmida za interlevkin 12 [4, 5].
- KAMENŠEK, Urška, SERŠA, Gregor, ČEMAŽAR, Maja. Neinvazivno in intravitalno slikanje za sledenje fizioloških procesov v realnem času na laboratorijskih miših. V: ZAVAŠNIK, Janez (ur.), et al. 2. slovensko posvetovanje mikroskopistov, 11. in 12. maj 2017, Piran, Slovenija: knjiga povzetkov = 2nd Slovene Microscopy Symposium : book of abstracts. 1. izd. Ljubljana: Slovensko društvo za mikroskopijo. 2017, str. 34. [COBISS.SI-ID 2658939]
- STAREŠINIČ, Barbara, KAMENŠEK, Urška, URŠIČ, Katja, ČEMAŽAR, Maja. Intravitalno slikanje redistribucije kalretikulina po izpostavitvi tumorjev elektroporaciji. V: ZAVAŠNIK, Janez (ur.), et al. 2. slovensko posvetovanje mikroskopistov, 11. in 12. maj 2017, Piran, Slovenija: knjiga povzetkov = 2nd Slovene Microscopy Symposium: book of abstracts. 1. izd. Ljubljana: Slovensko društvo za mikroskopijo. 2017, str. 66. [COBISS.SI-ID 2659195]
- URŠIČ, Katja, KOS, Špela, KAMENŠEK, Urška, ČEMAŽAR, Maja, ŠČANČAR, Janez, BUČEK, Simon, KRANJC, Simona, STAREŠINIČ, Barbara, SERŠA, Gregor. Comparable effectiveness and immunomodulatory actions of oxaliplatin and cisplatin in electrochemotherapy of murine melanoma. Bioelectrochemistry, ISSN 1567-5394. [Print ed.], Feb. 2018, vol. 119, str. 161-171, doi: 10.1016/j.bioelechem.2017.09.009. [COBISS.SI-ID 2756731]
- KAMENŠEK, Urška, ČEMAŽAR, Maja, LAMPREHT TRATAR, Urša, URŠIČ, Katja, SERŠA, Gregor. Antitumor in situ vaccination effect of TNF[alfa] and IL-12 plasmid DNA electrotransfer in a murine melanoma model. Cancer immunology and immunotherapy, ISSN 0340-7004, 2018, vol. , no. , str. [1-7], doi: 10.1007/s00262-018-2133-0. [COBISS.SI-ID 2877819],
- SAVARIN, Monika, KAMENŠEK, Urška, ČEMAŽAR, Maja, HELLER, Richard, SERŠA, Gregor. Electrotransfer of plasmid DNA radiosensitizes B16F10 tumors through activation of immune response. Radiology and oncology, ISSN 1318-2099. [Print ed.], Mar. 2017, vol. 51, iss. 1, str. 30-39, doi: 10.1515/raon-2017-0011. [COBISS.SI-ID 2609019]
- ČEMAŽAR, Maja, ŽNIDAR, Katarina, BOŠNJAK, Maša, SEMENOVA, Nina, PAKHOMOVA, Olga N., HELLER, Loree C. The role of DNA-specific pattern recognition receptors in electrotransfer of plasmid DNA into tumor cell lines. V: Program of the XXIV International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society, 3-7 July, 2017, Lyon, France. Lausanne: The Bioelectrochemical Society. 2017, str. 66. [COBISS.SI-ID 2724219]