OI Ljubljana
Eng

Novi pristopi radiosenzibilizacije tumorjev z gensko terapijo

 

Vsebinski opis projekta

Namen predlaganega projekta je bil razvoj novega pristopa genske terapije, ki združuje utišanje endoglina s tehnologijo RNA interference in genskim elektroprenosom kot dostavno metodo. Z namenom varnosti in boljšega ciljanja, smo najprej pripravili plazmid s tkivno specifičnim promotorjem za gen endotelin in z zapisom za shRNA proti endoglinu. Preverjali in dokazali smo njegovo učinkovitost in specifičnost z različnimi testi in vitro. To smo nadalje testirali na nivoju in vivo, kjer smo dokazali, da ima utišanje izražanja endoglina oba žilno ciljana učinka, antiangiogenega in žilno razdiralnega, ki privedeta do značilne radiosenzibiliazcije tumorjev. Kombinirana terapija, kjer je genski terapiji sledilo obsevanje, je privedla do značilnega deleža popolnih ozdravitev, v primeru melanoma pa tudi do spodbuditve trajnega imunskega spomina proti tem tumorskim celicam. Žilno ciljani učinek terapije smo spremljali neinvazivno v realnem času s pomočjo intravitalne mikroskopije dorzalnega okna ter z meritvami mikrocirkulacije. Z obema metodama smo dodatno potrdili prejšnja histološka opažanja ter dokazali, da se lahko z uporabo ene metode sklepa na dogajanje pri drugi. Hkrati smo dokazali, da imata plazmida, ki utišata izražanje endoglina, ne glede na promotor, primerljiva učinka, kar ima bi lahko dalo zagon nadaljnjim kliničnim študijam.

 

Faze projekta in njihova realizacija

Namen projekta je bil testirati specifičnost plazmida s tkivno specifičnim promotorjem in z zapisom za shRNA proti endoglinu v primerjavi s plazmidom s konstitutivnim promoterjem in vitro, ovrednotiti antiangiogeni, protitumorski in radiosenzibilirajoči učinek plazmidov na tumorskih modelih in raziskati mehanizme delovanja, povezane z utišanjem endoglina.

 

DS 1: Določitev tkivne specifičnosti plazmida s tkivno specifičnim promotorjem v primerjavi s plazmidom s konstitutivnim promotorjem

V tem delovnem sklopu smo uporabili plazmida, ki kodirata shRNA proti endoglinu (CD105) s konstitutivnim promotorjem (U6) in tkivno specifičnim promotorjem za endotelijske celice (endotelin-1). Tkivno specifičnost plazmida s tkivno specifičnim promotorjem smo ovrednotili in primerjali s plazmidom s konstitutivnim promotorjem na endotelijskih in tumorskih celičnih linijah in vitro, ki izražajo ali ne izražajo endoglina (Tešić, 2015; Štimac, 2015). Ugotovili smo, da s plazmidom, ki ima konstitutivni promotor, nespecifično utišamo večji delež celic, medtem ko s plazmidom s tkivno specifičnim promotorjem specifično utišamo izražanje endoglina predvsem na endotelijskih celičnih linijah. Z obema plazmidoma smo izvedli tudi funkcionalne teste za določitev antiangiogene, citotoksične in antimigratorne aktivnosti plazmidov po genskem elektroprenosu (GET) na različnih celičnih linijah (Tešić, 2015; Dolinšek, 2015; Štimac, 2015). Ugotovili smo, da imata plazmida enak antiangiogeni učinek na endotelijskih celicah, zmanjšata njihovo migracijo celic ter imata citotoksični učinek. Na celičnih linijah, ki endoglina ne izražajo, je bil učinek statistično neznačilen in primerljiv s samim GET. Rezultati tega delovnega sklopa kažejo na obetavno uporabo varnih in tkivno specifičnih plazmidov, ki še bolj specifično ciljajo in posledično ne izzovejo stranskih učinkov.

 

DS 2. Določevanje protitumorske učinkovitosti plazmidov, ki kodirajo shRNA proti endoglinu s konstitutivnim in tkivno specifičnim promotorjem, kot samostojna terapija ali v kombinaciji z obsevanjem

V tem delovnem sklopu smo določili protitumorsko učinkovitost dveh plazmidov, ki kodirata shRNA proti endoglinu s konstitutivnim in tkivno specifičnim promotorjem, kot samostojno terapijo ali v kombinaciji z obsevanjem na mišjih tumorskih modelih. Protitumorsko učinkovitost GET plazmidov smo določevali v avaskularni in vaskularni fazi rasti tumorjev ter ugotovili, da ima utišanje izražanja endoglina oba žilno tarčna učinka; antiangiogenega ter žilno razdiralnega (Dolinšek, 2015; Štimac, 2016). V obeh primerih je prišlo do značilnega zaostanka v rasti tumorjev, kar je bila posledica učinka na žilje, saj smo uporabili karcinom dojke TS/A, katerega celice ne izražajo endoglina. Na melanomu z visokim izražanjem endoglina je bil protitumorski učinek bolj izrazit in dosegli smo tudi visok delež ozdravitev (Savarin, 2017; Štimac, 2016;  Tešić, 2015; Dolinšek, 2015). V kombinaciji z obsevanjem je bil protitumorski učinek še bolj izrazit, kar nakazuje na dober radiosenzibilizirajoči učinek GET plazmidov, ki utišajo izražanje endoglina. Na ta način smo lahko ločili vpliv terapije na tumorsko žilje od neposrednega vpliva terapije na tumorske celice. Ocenili smo tudi poškodbe normalnega tkiva (koža) po kombinirani terapiji ter ugotovili, da je terapija varna. Kombinirana terapija je na obeh tumorskih modelih privedla do visokega deleža popolnih ozdravitev, kar kaže na potencialno uporabo tudi v kliniki.

 

DS 3. Raziskovanje osnovnih mehanizmov utišanja endoglina z GET (meseci: 19-36)

V tem delovnem sklopu smo raziskovali osnovne mehanizme delovanja GET dveh plazmidov, ki kodirata shRNA proti endoglinu, s konstitutivnim ali tkivno specifičnim promotorjem samostojno ali v kombinaciji z obsevanjem tumorjev. V ta namen smo določali histološke spremembe po GET v kombinaciji z obsevanjem tumorjev, vaskularne spremembe na modelu dorzalnega okna in merili mikrocirkulacijo - pretok krvi. Histološke analize tumorjev iz prejšnjih sklopov so potrdile naša predvidevanja; utišanje izražanja endoglina z GET ima oba žilno ciljana učinka, kar smo opazili pri obeh tumorskih modelih in v obeh fazah rasti, ker posledično zmanjšuje proliferativnost celic, poveča pa delež apoptotskih, hipoksičnih in nekrotičnih celic v tumorjih (Štimac, 2015; Savarin, 2017; Dolinšek, 2015; Tešić, 2015). Zanimalo nas je tudi, kaj se v dogaja skozi daljše časovno obdobje v realnem času, zato smo učinke takega GET, samega in v kombinaciji z obsevanjem, preverjali na modelu dorzalnega okna (Dolinšek, 2015; Savarin – oddano v recenzijo). Ugotovili smo, da je učinek GET hiter in se opazi že dan po GET, samo obsevanje pa na žilje nima bistvenega učinka. S fiziološkimi meritvami sprememb v krvnem pretoku smo na istem modelu dorzalnega okna lahko potrdili prejšnja opažanja ter dodatno dokazali oba žilno ciljanja učinka kot posledico utišanja izražanja endoglina, kar omeji nadaljnjo rast tretiranih tumorjev. Poleg tega smo ugotovili, da se neinvazivni metodi lahko uporabljata v daljšem časovnem obdobju ter da z meritvami ene lahko sklepamo na dogajanja pri drugem dogodku. To je odlično izhodišče tudi za nadaljnje klinične študije, kjer bi lahko z uporabo tega znanja določali terapevtski učinek terapij.

 

 

 

 

© 2019 - Onkološki inštitut Ljubljana
Za slepe in slabovidne(CTRL+F2)
barva kontrasta
velikost besedila
označitev vsebine
povečava